复合菌剂及其用途的制作方法

本发明涉及微生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种复合菌剂及其用途。

背景技术：

真菌毒素是由真菌产生的有毒次级代谢物，可污染包括花生、玉米、小麦、坚果和香辛料等在内的几乎所有农作物及食品。而黄曲霉毒素(afs)是最常见的真菌毒素之一，也是目前发现的毒性最强的真菌毒素。afs是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，主要危机人和动物肝脏，具有致畸、致突变和致癌等作用。目前已鉴定出20多种afs及其衍生物，其中5种较为常见，分别为黄曲霉毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)、g2(afg2)、m1(afm1)，而afb1最为常见、且毒性最大，被国际癌症机构列为i类致癌物。

目前对黄曲霉菌的防控方法多为物理方法和化学方法和生物方法，物理方法有紫外线、γ-射线照射；化学方法有杀菌剂、二氧化硫、多酚类化合物和精油熏蒸等。利用物理化学方法抑菌存在成本高、效率低、营养损失等缺点，因此亟需设计一种能够一定程度克服上述缺陷的技术方案。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种复合菌剂及其用途，该复合菌剂能够有效抑制黄曲霉生长和产生毒素，成本较低、效率高、农作物无营养损失。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了复合菌剂，包括异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母，所述异常威克汉姆酵母于2020年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20837；所述美极梅奇酵母于2020年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20838。

进一步地，所述的复合菌剂，所述异常威克汉姆酵母和所述美极梅奇酵母的浓度比范围为1:3至3:1。

进一步地，所述的复合菌剂，所述异常威克汉姆酵母和所述美极梅奇酵母的浓度比为3:1。

根据本发明的另一个方面，所述的复合菌剂的用途，用于抑制黄曲霉生长。

根据本发明的又一个方面，所述的复合菌剂的用途，用于抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素。

进一步地，所述的复合菌剂的用途，所述黄曲霉毒素为afb1。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的复合菌剂包括异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母，能够较好地用于抑制农作物及食品中黄曲霉的生长和毒素的产生。本发明相比于物理方法和化学方法，至少具有成本较低、效率高、农作物及食品无营养损失等优点。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为不同浓度的酵母与黄曲霉共培养对黄曲霉生物量的影响图；

图2为酵母上清与黄曲霉共培养对黄曲霉生物量的影响图；

图3为混合酵母在平板上对黄曲霉的抑制效果图；

图4为混合酵母在平板上对黄曲霉产毒的抑制效果图；

图5为酵母混合发酵对花生粕中黄曲霉素生长的抑制效果图；

图6为酵母混合发酵对花生粕中黄曲霉产毒的抑制效果图；

图7为固态发酵产物的粗蛋白含量图；

图8为固态发酵产物的多肽含量图；。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本申请的实施例提供了复合菌剂，包括异常威克汉姆酵母(wichkerhamomycesanomalus)和美极梅奇酵母(metschnikowiapulcherrima)，所述异常威克汉姆酵母于2020年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20837，；所述美极梅奇酵母于2020年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20838。

在另一些实施例中，所述异常威克汉姆酵母和所述美极梅奇酵母的浓度比范围为1:3至3:1。

在另一些实施例中，所述异常威克汉姆酵母和所述美极梅奇酵母的浓度比为3:1，该比例能够完全抑制afb1的产生，又能最大程度地抑制黄曲霉生长。

本申请的实施例还提供了复合菌剂的用途，用于抑制黄曲霉生长，可用于需要抑制黄曲霉的场合，如农作物及食品保存。

本申请的实施例还提供了复合菌剂的用途，用于抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素。

在另一些实施例中，所述黄曲霉毒素为afb1。

以下以多个具体实施例具体说明：

1、不同浓度的酵母与黄曲霉共培养对黄曲霉生物量的影响

稀释异常威克汉姆酵母(no.13)和美极梅奇酵母(no.25)的浓度到2×10⁴，2×10⁵和2×10⁶cells/ml，分别取1ml酵母液接种到20mlypd液体培养基中，对照组为1ml无菌水；同时分别接种1ml的2×10⁶cfu/ml的黄曲霉孢子液到培养基中，28℃，180rpm培养7d。滤纸过滤分别收集菌丝，放入烘箱烘干，称重，计算酵母对黄曲霉生物量的影响。如图1所示，酵母与黄曲霉共培养后，可显著抑制黄曲霉生物量的增加，随着酵母浓度增加，抑制率增加。其中异常威克汉姆酵母对黄曲霉生物量的抑制强于美极梅奇酵母，当常威克汉姆酵母no.13浓度为2×10⁶cells/ml是对黄曲霉生物量抑制最强，抑制率达97％，相同浓度美极梅奇酵母对黄曲霉生物量抑制率为77％。

2、酵母上清与黄曲霉共培养对黄曲霉生物量的影响

稀释筛选得到的异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母的浓度到2×104cells/ml，分别取100μl酵母液接种到40mlypd液体培养基中，28℃，180rpm培养24h，1000rpm离心10min收集上清液，上清液过0.22μm无菌滤膜，得酵母上清液。取20ml酵母上清液，对照组为20ml的ypd液体培养基，接种1ml的2×106cfu/ml的黄曲霉孢子液到培养基中，28℃，180rpm培养3d。滤纸过滤分别收集菌丝，放入烘箱烘干，称重，计算酵母对黄曲霉生物量的影响。如图2所示，酵母上清液可显著抑制黄曲霉生物量的增加，异常威克汉姆酵母上清液对黄曲霉生物量抑制效果较好，抑制率为77％，美极梅奇酵母对黄曲霉生物量的抑制率为68％。

3、混合酵母在平板上对黄曲霉的抑制及产毒效果

稀释得到的异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母的浓度到2×104cells/ml，同时配置异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母浓度比为1:3，1:1和3:1，终浓度为2×104cells/ml的混合酵母液。取配置的酵母液100μl分别涂布到ypd培养基，对照组(ck)为100μl的无菌水。取到2×106cfu/ml的黄曲霉孢子液5μl接种到已接种酵母的ypd固体培养基正中央，28℃黑暗条件下培养，采用十字交叉法每天测量黄曲霉菌落直径计算抑菌率，培养5d后，每个培养皿中加入10ml的100％甲醇，提取afb1毒素，hplc检测黄曲霉afb1产量。异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母抑制黄曲霉生长和产毒情况分别见图4、图5。每组数值均代表3个重复的平均值。

如图3所示(no.13代表异常威克汉姆酵母；no.25代表实施例1筛选得到的美极梅奇酵母；1:3，1:1和3:1代表异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母浓度比例)，no.13和no.25对黄曲霉均有抑制效果，其中no.13对黄曲霉的抑制率达72％，no.25对黄曲霉抑制率仅为25％，而混合菌中随着no.13比例的增加，抑制率上升，当no.13和no.25比例为3:1时，抑制率达72％。抑制率(％)＝100％×(对照组黄曲霉直径-实验组黄曲霉直径)/对照组黄曲霉直径。如图5所示，no.13和no.25可显著抑制黄曲霉产afb1。对照组黄曲霉产afb1量为17μg/ml，no.13和no.25组黄曲霉产afb1量分别为0.11μg/ml和0.01μg/ml，而混合酵母可完全抑制黄曲霉产afb1。

4、酵母混合发酵在花生粕中的应用

稀释异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母的浓度到2×104cells/ml，同时配置异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母浓度比为1:3，1:1和3:1，终浓度为2×104cells/ml的混合酵母液。配置2×106cfu/ml的黄曲霉孢子液。花生粕过30目筛，称取100g花生粕放入发酵盒中，加入30ml无菌水，混匀。按照3％接种量分别接种不同种类和比例酵母菌液，同时按照0.6％接种量分别接种黄曲霉孢子液。28℃培养箱发酵，每12h搅拌一次，发酵5d。发酵结束后拍照观察。最后将发酵结束的花生粕加入等体积甲醇，180rpm震荡1h提取afb1，震荡结束后吸取2ml提取液用免疫亲和柱提取afb1，然后用高效液相色谱检测afb1浓度。

如图4和图5所示，与培养皿上两种酵母抑制黄曲霉效果一致，异常威克汉姆酵母抑制黄曲霉生长效果明显，而美极梅奇酵母抑制黄曲霉产毒效果明显。如图6所示，异常威克汉姆酵母抑制花生粕中黄曲霉菌生长效果好于美极梅奇酵母，而两种酵母混合发酵，随着异常威克汉姆酵母比例升高抑制花生粕中黄曲霉菌生长效果增强。如图6所示，美极梅奇酵母(0.67μg/g)抑制黄曲霉产毒效果好于异常威克汉姆酵母(0.81μg/g)。而当两种酵母混合发酵时，随着异常威克汉姆酵母比例的增加，黄曲霉菌产afb1能力先减后增。当异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母比例为3:1时，抑制黄曲霉生长及产毒效果达到最佳。

5、酵母混合发酵对粗蛋白和多肽含量的影响

稀释异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母的浓度到2×10⁴cells/ml，同时配置异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母比例为3:1，终浓度为2×10⁴cells/ml的混合酵母液。配置2×10⁶cfu/ml的黄曲霉孢子液。花生粕过30目筛，称取100g花生粕放入发酵盒中，加入30ml无菌水，混匀。按照3％接种量分别接种不同种类和比例酵母菌液，同时按照0.6％接种量分别接种黄曲霉孢子液。阳性对照组(ck)不添加酵母，添加黄曲霉，阴性对照组(nc)不添加酵母和黄曲霉，28℃培养箱发酵，每12h搅拌一次，发酵48h取样，测定花生粕中粗蛋白和多肽的含量。粗蛋白测定采用凯氏定氮法；氨基酸测定采用高效液相色谱法。

如图7所示，单独采用异常威克汉姆酵母和混合发酵均比单独采用美极梅奇酵母no.25的固态发酵产物粗蛋白含量高，且高于阴性对照组和阳性对照组。酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故对复杂的蛋白质不能利用，而对一些简单的含氮化合物能进行一定程度的利用，美极梅奇酵母单独发酵对其利用率低，但与异常威克汉姆酵母混合固态发酵，能增加对花生粕中原料的利用率，提高其粗蛋白含量。如图8所示，单菌和混合发酵48h后，阳性对照组和试验组多肽含量与无发酵的阴性对照组相比均有提高，分别提高了10.24％、22.37％、18.67％和8.46％。因此，异常威克汉姆酵母no.13和美极梅奇酵母no.25比例为3:1时，混合固态发酵能提高花生粕中粗蛋白和多肽的含量，可显著提高花生粕中的营养成分。

6、总结

酵母上清液具有抑制黄曲霉生长及产毒效果，表明复合菌剂的抑制效果源于异常威克汉姆酵母和美极梅奇酵母产生的物质，而非该两种酵母菌本身。复合菌剂对平板上和花生粕中的黄曲霉素的生长和产毒均具备良好的抑制效果，还能够显著提升花生粕中的营养成份。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明复合菌剂及其用途的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。