专利名称:毕赤属酵母基因组选择性定点修饰的制作方法
本发明是关于重组DNA技术。一方面涉及酵母的整合转化，另一方面涉及酵母的定点突变。本发明还涉及一些新的DNA序列及一些新的生物体。
随着近年来重组DNA技术的发展，人们可以通过各种微生物有目的地生产各种有用的多肽。已经通过微生物生产出许多真核生物的多肽。诸如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人胰岛素原。应用这些已知的技术还将进而生产更多种类的多肽产品。
经常用于重组DNA技术的基本因素是质粒，它是存在于许多微生物中的染色体外双链DNA。在微生物中天然产生的质粒经常是以每个细胞多个拷贝存在着。除了天然质粒外，人们还制备了很多人造质粒或杂交载体。但不幸的是，质粒不总是保持在宿主细胞中。在生物繁殖过程或经过几代的生长后，可能失去质粒。因而人们的兴趣就集中在如何将外源DNA引入合适的宿主生物，这种引入的方法具有很大的潜在价值。
迄今，工业应用重组DNA技术生产各种多肽时大多使用大肠杆菌作为宿主。然而有时大肠杆菌被证实不适合作为宿主，例如它含有一些毒性致热物质，而当产物多肽药用时必须将其除去。而提纯产品肽的效率则因不同的肽而异。此外，大肠杆菌的分解蛋白活性也可能大大限制一些有用产品的产率。而且一些异种基因在大肠杆菌中的表达产物也以不可溶的形式产生。这种种原因，使人们更希望能找到其它的宿主。特别是期望用真核生物来生产多肽产品。
在真核系统如，酵母中生产多肽产品比用大肠杆菌生产重组DNA编码的多肽可能有更大的优越性。与近年来出现的大肠杆菌大规模发酵相比较，用酵母大规模发酵已有几个世纪的历史。酵母可以比细菌高得多的密度生长，而且容易采用连续发酵工艺。美国人Wegner指出，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞可生长到超高密度，即每升超过100克的细胞密度(见美国专利4，414，329，已转让给飞利蒲石油公司)。酵母的优点还在于它有很多重要特性，如它的氧化磷酸化是在细胞器内进行的，因此在生产对于野生宿主细胞是外源的多肽时，不会显示出由此引起的毒性。作为真核生物，酵母能糖基化表达的多肽产物。这是非常有价值的，因为糖基化对多肽产物的生物活性至关重要。作为真核生物，酵母与高等生物有相同的密码优选特性，从而可更有效地生产哺乳动物基因的表达产物或从哺乳动物信息RNA反向转录的互补DNA表达的产物。但由于缺乏转化条件及将外源DNA稳定引入宿主细胞的合适手段等方面知识，使得以酵母作为宿主载体系统进展仍然较慢。加之，不常用它们的营养缺陷型，阻碍了通过营养缺陷物的补充直接选择转化体的应用。如果希望将酵母用于重组DNA技术，必须设计出新的宿主/载体系统，使其有利于DNA操作及优化插入的DNA序列的表达，从而在可控条件下，高产率生产所需多肽产品。
本发明的目的之一是提供在酵母基因选择的定点插入DNA的方法。
本发明另一目的是制备基本上不逆转的稳定的酵母营养缺陷型突变的方法。及该突变菌株。
本发明再一目的是制造一个醇类氧化酶缺失突变宿主，以增加在酵母中生产异种蛋白。
以上这些发明目的在下面说明书及权利要求
书中将更清楚。
根据本发明，发展了一种毕赤酵母属基因组定点修饰的方法。用一个线性DNA片段转化酵母。包括在每端插入如宿主基因组的同质序列的可插入DNA序列，每端至少插入200个碱基，再在中间插入一个附加序列例如可选择的标记基因，其间的标记基因及两侧的可插入DNA序列都以高频率被宿主摄取。用该线性DNA转化的结果，生成了修饰的酵母菌株，其中整合点的DNA序列被破坏和/或被去除，而可选择的标记基因及任何其它基因则作为转化用线性DNA片段的部分被整合到宿主酵母的基因组中。
以上述方式插入到宿主酵母的基因组的外源DNA，经过宿主几代的生长，稳定的保存着。本发明的实践消除了当作为自我复制的染色体外的外源DNA取代原有一部分或当外源DNA作为环状DNA分子部分整合到基因组时，质粒不稳定导致外源DNA失去的问题。这种环状DNA分子整合导致由于宿主基因组序列直接重复到宿主基因组侧面插入外源DNA序列。由于这种直接重复顺序是进一步重组的底物，所以插入到直接重复序列间的外源DNA是不稳定的。
本发明的直接定点基因组修饰使得可以生产缺少特定基因全部或选择部分的突变。通过除去对某种所需突变的基因实质部分，从而排除突变逆转的可能。根据本发明所得的突变菌株是非常稳定的突变。
本发明的直接定点基因组修饰与本领域专业人员熟知的体外DNA重组技术一起应用可以准确地修饰各种宿主基因组，例如在宿主基因组上加一个或多个外源基因，改变控制天然基因表达的调节序列，用一个非天然基因代替一个天然基因等等。
人们吃惊地发现，在毕赤诱导外源基因表达的甲醇在毕赤第一个醇类氧化酶基因被破坏的毕赤菌株中表达急剧增加。
进而又发现，巴斯德毕赤还有第二个醇类氧化酶基因，当菌株的第一醇类氧化酶基因破坏时，这第二个醇氧化酶基因使该菌株仍可在甲醇上生长，只是没有天然的毕赤生长快。
图1是质粒PYM I1的内切酶点图。
图2表示将质粒PYM I1的一部分插入到毕赤染色体中的H I S4位点。
图3是质粒PY J8的内切酶点图。
图4是质粒PYM I3a的内切酶点图。
图5表示将质粒PYM I3a的一部分插入毕赤染色体的H I S4位点。
图6是质粒PBPG1-1的内切酶切点图。
图7是质粒PYM I7的内切酶切点图。
图8表示将质粒PYM I7的一部分插入毕赤染色体的醇氧化酶位点。
图9表示从质粒PSAOH5和PTHBS3组建质粒PYM39。
图10表示从质粒PYM39和pPG3.2组建质粒PYM I6。
图11表示从质粒PYM I6和PBSAG5 I组建质粒PBSAG I5 I。
图12是比图11更详细的质粒PBSAG I5 I内切酶切点图。
图13表示将质粒PBSAG I5 I的一部分插入到毕赤染色体的醇氧化酶位点。
图14是质粒PYM I12a的内切酶切点图。
图15表示将质粒PYM I12a的一部分插入到第二个毕赤醇氧化酶基因(AOX2)的位点。
图16是在基于PBR322的质粒pPG4.0和pPG3.0中毕赤插入体的内切酶切点图。图16a所示的插入来自第一个毕赤醇氧化酶基因(AOX1)的位点，而图16b所示插入来自第二个毕赤醇氧化酶(AOX2)位点。图16c表示已知的AOX1基因位点的醇氧化酶(AOX)编码部分(参考图16a)。
图17是质粒PYM25的内切酶切点图。
图18是质粒PT76H3的内切酶切点图。
下面通篇所用的缩写代表的酶如下缩写 内切酶AS ASuⅡ
B BamH ⅠB Bgl ⅡC Cla ⅠR1EcoR ⅠR5EcoR ⅤH Hind ⅢHp HpaⅠKp HpnⅠNr NruⅠPs PstⅠRV2PvuⅡRs RSa ⅠS Sal ⅠS3Sau3 A ⅠSm Sma ⅠSp Sph ⅠSt Stu ⅠTh Tha ⅠXb Xba ⅠXh Xho Ⅰ在附图中，用于DNA片段切割及连接的内切酶切点用上述缩写表示。
本发明提供毕赤属酵母基因组定点修饰的方法，该方法包括用含有第一个可插入DNA片段一个可选择的标记基因和第二个可插入的DNA片段的系列线性排列的DNA片段转化宿主菌株。第一个和第二个可插入DNA片段都至少有约200个核苷酸长，并在天然毕赤基因组修饰点有与该基因组一部分同质的核苷酸顺序。可选择的标记基因应在得到该基因的细胞中表达出可供选择的表现型，诸如，抗生素抗性基因或一个使细胞能合成生长所需营养的生物合成基因。当可选择的标记基因在DNA载体上时，将仅使接受该载体DNA的细胞在选择的生长条件下生长。可选择的标记基因必须在第一和第二可插入DNA片段之间，而可插入DNA片段在用线性DNA片段进行基因组修饰时，二者都必须位于宿主细胞基因组的相同方向。
本发明还提供了含有一个第一可插入DNA片段，一个可选择的标记基因和一个第二可插入DNA片段的系列排列的线性DNA片段。第一和第二可插入DNA片段都至少有约200个核苷酸长，而且具有与毕赤属各种基因组DNA的一部分同质的核苷酸序列，这第一与第二可插入DNA片段在基因组中彼此的方向相同。标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。
根据本发明转化毕赤属各种菌株基本因素含有至少三个成分一个第一可插入DNA片段，一个第二可插入DNA片段，和一个可选择的标记基团。
第一个和第二个可插入DNA片段都需具有至少约200个核苷酸，可用达200到5，000个核苷酸的片段，为使操作简便，最好用500到2，000个核苷酸的片段。
用于第一和第二可插入DNA片段在天然毕赤基因组修饰点有与核基因一部分同质的核苷酸顺序。因此，如果基因组修饰发生在醇氧化酶基因，则所用的第一和第二可插入DNA片段是与醇氧化酶基因的某一部分同质。插入的这两个片段在毕赤基因组的相对方向是一致的。
用于实施本发明的转化DNA的三个起码成分是系列排列成线性DNA片段，其中可选择的标记基因位于第一和第二可插入片段之间。可选择的标记基因包括巴斯德毕赤(Pichia Pastris)和酿酒酵母(Saccharomyus cerevisiae)的ARG4基因，巴斯德毕赤和酿酒酵母的HIS4基因，大肠杆菌可易位因子Tn 601的G418磷酸转移酶等，但不限于这些酶。本领域的专业人员也认识到一些合适的两侧序列，即第一和第二可插入DNA片段，可以是从巴斯德毕赤基因组分的基因中得到的，例如醇氧化酶基因(AOX1和AOX2);毕赤具有两个醇氧化酶基因，二羟丙酮合成酶基因(DAS)，精氨基琥珀酸酯裂解酶基因(ARG4)，组氨醇脱氢酶基因(HIS4)等，但不限于这些基因。
转化用线性DNA片段还可包括一些其它的DNA序列，如异种基因，即正常情况不存在于基因组发生插入的位点中，而希望能在巴斯德毕赤中表达的任何基因的一部分。一般地说，异种即不是宿主毕赤细胞中固有的。异种基因可任意地与独立控制产生异种基因产物的调节区结合，异种基因可在转化过程破坏基因的调节区影响下在转化细胞中表达。
此外，转化用线性DNA片段也可能包括细菌质粒DNA，诸如PBR322或PBR325序列。这些细菌是在体外操作和在含这些DNA顺序的大肠杆菌中扩大生产中应用的一种用于转化的特别有用的形式，线性DNA作为一个封闭的环状质粒，包含一个第一可插入DNA片段，一个第二可插入DNA片段，一个可选择的标记基因，和细菌质粒DNA。
这个质粒也可含有如上所述的附加DNA序列。
在优选的实施例中，封闭的环状质粒是由两部分组建的，“转化部分”和“细菌部分”。转化部分包括系列排列的第一可插入DNA片段，可选择标记基因和第二可插入DNA片段。其中的第一和第二可插入DNA片段在毕赤基因组中排列方向是相同的。可选择的标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。细菌部分将第一和第二可插入DNA片段连接，形成一个闭合的环状载体。
如上段叙述，制备的闭合环状载体在大肠杆菌中生产大量质粒，然后分离质粒，用合适的限制酶酶解，从细菌部分切下转化部分，这线性的酵母DNA转化部分就可再用于转化毕赤属的各种菌株，从而根据需要修饰了基因组。
当然，本领域的专业人员懂得，上述闭合环状质粒的“转化部分”还可含附加DNA序列。例如用于体外操作和在大肠杆菌中扩大生产DNA的细菌顺序，像可选择的标记基因序列一样，也位于第一和第二可插入片段之间。用于转化的各种DNA成分构建时，细菌序列也将根据本发明的基因组修饰方法整合到宿主酵母基因组中。
巴斯德毕赤的转化已在转让给飞利蒲石油公司Stroman等人的共同未决申请No666，579中叙述过了。下面也详述了用于巴斯德毕赤转化的试验步骤。(见例1)，可通过酶解细胞壁先得到环状原生质体的方法转化毕赤属酵母菌株。将球状体与转化用DNA混合，在有钙离子和聚乙二醇存在下温育，然后在选择生长培养基中再生细胞壁。转化用DNA包括一个可供选择的标记基因，它使人们可以选择摄取了转化DNA的细胞，因为在所用选择条件下只有转化了的细胞才可以存活和生长。选择条件是与作为转化用DNA一部分的可供选择的标记基因有关的)。
当用第一醇类氧化酶基因(AOX Ⅰ)被破坏的毕赤菌株作为表达异种基因的宿主时，令人惊奇的发现，在一些启动子控制下(如AOX Ⅰ或DAS启动子)该宿主中异种基因产物的表达水平比用醇氧化酶完全感受态的宿主时增加几倍。由此观察结果，进而探索这个现象，肯定了增加宿主中异种基因的表达水平包括使该宿主生长在营养限制条件下，该条件下存在有对底物反应强的启动子区，异种基因就在这个底物反应强的启动子区调整之下表达的。
根据本发明为增加基因表达所需的营养限制条件可通过控制培养细胞的营养量或突变的方法来提供，突变宿主在一定生长条件下就限制了营养。例如，在强醇氧化酶或二羟丙酮合或酶启动子调控下，要想提高异种基因的表达水平，这两个启动子对培养其中存在的甲醇都有反应，无论在利用甲醇方面有部分缺陷的宿主或在限制甲醇的生长条件下，醇氧化酶完全感受态的宿主都将提供所需的营养限制条件，从而加强了基因的表达。
这里所述加强异种基因产物表达的方法是用于其启动子与营养限制相呼应的任何生物的一般方法。因此，通过将一个异种基因置于这样的启动子区调控下，再在能使该启动子强力启动的营养限制条件下培养宿主，就可以增加该基因的表达。提供营养限制条件的优选方法是应用突变菌株，该突变株代谢某种养分的能力有部分缺陷，从而使一些启动子可在突变菌株中比非突变株中以高得多的水平启动表达。在毕赤中的这种表达我们将在例Ⅴ中详述。
将用本发明的基因组修饰方法破坏了第一醇氧化酶的巴斯德毕赤菌株培养在用甲醇作为碳源的培养基上时，吃惊地发现它们仍能生长，只是生长率比野生型降低了。该结果说明在利用甲醇的毕赤菌株中可能存在第二醇氧化酶。
在筛选毕赤染色体DNA时，分离出一个3千对碱基的片段，它似乎是为第二醇氧化酶基因(AOX2)的一部分编码的。该片段已插入到PBR322(在唯一的BamHI切点)质粒中贮存起来。该质粒称为p PG30，在大肠杆菌宿主LE392中携带。这个菌株已贮存在美国伊利诺州Peoria的美国农业部北部地区研究中心，贮藏号为NRRL B-18022。
p PG3.0的限制酶切图示在图16b，并将它与第一醇氧化酶基因p PG4.0的一个片段相比较。后者在Stroman等人转让给飞利蒲石油公司的共同未决申请No666，391中已详述。比较两个醇氧化酶，(见图16)使人们更明确这两个片段不是同一基因位点的两个重复区。但两个片段的同质部分也是很清楚的。它们有几个共同的限制酶切点，这已用星号表示在图16中。一些不同的限制酶切点也说明它们在核苷酸水平上的差异。
下面将通过实例叙述本发明，但不限制本发明。
用于下面例子中的缓冲液及溶液如下1M·Tris缓冲液将121.1克Tris碱溶在800毫升水中;用35%HCl调节pH至所需值，达最终pH值前将溶液冷却至室温，再稀释到终体积1升。
TE缓冲液1.0mM EDTA溶在0.01M(pH7.4)的Tris缓冲液中。
LB培养基(Luria-Bertani)将5克细菌用胰化胨，5克细菌用酵母提取物，2.5克Na Cl悬在1升水中，用Na OH将pH调至7.5。
2B培养基0.2%NH4PO4，1.2%Na2HPO4。0.013%MgSO4·7H2O，0.074%Ca Cl2·2H2O，2微克/毫升生物素，1微克/毫升硫胺素，100微克/毫升色氨酸，0.4%葡萄糖，0.2%酪蛋白氨基酸。
YPD培养基1%细菌用酵母提取物，2%细菌用胨，2%葡萄糖。
SD培养基6.75克不含氨基酸的酵母含氮碱溶于1升水的2%葡萄糖。
SED1M山梨醇，25mM EDTA，50mMDTT。
SCE缓冲液9.1克山梨醇，1.47克柠檬酸钠，0.168克EDTA，加水至50毫升，用盐酸将pH调至5.8。
Ca S1M山梨醇，10m M Ca Cl2，灭菌过滤。
PEG溶液20%聚乙二醇3350，10mMCaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)，灭菌过滤。
So S1M山梨醇，0.3xYPD培养基，10m MCa Cl2。下列缩写的意义如下EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠DTT 二醇苏糖醇例1巴斯德毕赤转化步骤A.细胞培养1.将一个巴斯德毕赤GS115(NRRL Y-15851)保温培养在约10毫升YPD培养基，在30℃摇动培养12-20小时。
2.12-20小时后，将培养液稀释到在600纳米处光密度约为0.01-0.1时，将对数生长期的细胞在YPD培养基中继续于30℃下培养约6-8小时。
3.6-8小时后，用0.5毫升在600纳米处光密度约为0.1的种子培养液置于100毫升的YPD培养基中保温培养，在30℃下摇动培养12-20小时。
4.当培养液细胞生长到在600纳米处光密度约为0.2-0.3时(约16-20小时)以1500g离心5分钟收集培养物。
B.制备球状体1.在10毫升无菌水中洗收集的细胞一次，(1-5步的离心均以1500g速度，离心5分钟)。
2.在10毫升的新鲜SED中洗细胞一次。
3.在10毫升的无菌1M山梨醇液中洗细胞两次。
4.将细胞重悬在10毫升的SCE缓冲液中。
5.加入5～10毫升的4毫克/毫升的酵解酶60，000(来自Miles试验室)。将细胞在30℃下保温培养约30到60分钟。
由于制备球状是转化的关键步骤，需要用下列步骤监测球状体的生成将100微升的细胞在加入酵解酶(zymolyase)前或刚加入后及在温育的不同时间加入900微升的50%SDS和900微升的1M山梨醇。当细胞在SDS中已裂解而在山梨醇中未裂解时停止温育。(通常为30到60分钟)。
6.将球状体在10毫升无菌1M山梨醇中洗两次，再在1000g下离心5～10分钟收集之。(离心时间和速度可以变化)，离心使球状体沉淀又不会破裂。
7.用10毫升无菌Ca S洗细胞一次。
8.用0.6毫升无菌Ca S重悬细胞。
C.转化1.将DNA样品(多达20微升体积)置于12×75毫米的无菌聚丙烯试管中(DNA溶在水或TE缓冲液中，为使其用少量DNA最大限度地转化，建议每个样品中加约1微升浓度为5毫升/毫升超声处理的大肠杆菌DNA。)2.每个DNA样品加100微升球状体，室温下温育20分钟。
3.每个样品加入1毫升PEG溶液，室温下温育约15分钟。
4.在1000g下离心样品5～10分钟，除去PEG溶液。
5.将样品重悬在150微升的SOS中再在室温下温育30分钟。
6.加入850微升无菌1M山梨醇，再按下述步骤平板培养。
D.再生球状体1.再生琼脂培养基的配方a.将9克细菌用琼脂，13.4g KCl，240毫升H2O配制成琼脂-KCl，高压灭菌。
b.将20克葡萄糖加100毫升H2O中，高压灭菌制成10X葡萄糖液。
c.将6.79克不含氨基酸的酵母含氮碱加入100毫升水，高压灭菌制备10×SC(高压灭菌前或后加入任何所需氨基酸或核酸使其浓度达200微克/毫升)。
d.将30毫升10×葡萄糖液和30毫升10×SC液加入240毫升融化的琼脂-KCl溶液。加0.6毫升0.2毫克/毫升的生物素和浓度高达20微克/毫升的任何其它所需氨基酸或核酸。再生琼脂是在55～60℃下融化的。
2.制备转化样品的培养平板制备转化样品前至少30分钟，将10毫升再生琼脂倾入每个平板每个平板培养皿。当转化样品在SOS液中时，将10毫升再生琼脂倾入各试管。将上述制备的每份转化样品加入各试管内，然后再倾入培养皿的底部琼脂层。
3.测定球状体制备质量取出10微升的某个样品，用99微升的1M山梨醇将其稀释100倍。再取出稀释的样品10微升，再用990微升1M山梨醇再稀释100倍，将100微升的两次稀释样品涂到含YPD培养基的琼脂平板，测定残留在制备液中的未成球状体的完整细胞。取每个稀释样品100微升，加到10毫升的补加40微克/毫升组氨酸的再生琼脂，测定总体可再生球状体。转化试验的良好值为每毫升含1-3×107总体可再生球状体及每毫升含约1×103的完整细胞。
4.将平板在30℃下保温培养3-5天。
例2在GS190(NRRL Y-1804)中定点插入Sacchayomyces ARG4基因和删掉毕赤HIS4图1表示质粒PYM I1，图2表示质粒定点插入到巴斯德毕赤基因组的情况。通过载体将Saccharomyces ARG4基因和来自PBR322的DNA序列插入毕赤HIS4位点，同时删掉了整个HIS4基因。诸如表达区的其它顺序也可容易地插入到PYM I1中，然后同时整合到巴斯德毕赤基因组。
质粒PYM I1是由位于毕赤HIS4基因5′端的EcoR I-BamH Ⅰ片段和位于毕赤HIS4基因3′端的EcoR I-Cla I片段构成的。这两个HIS4基因的两侧片段可由质粒PYJ18得到(它存在于大肠杆菌宿主中，可从美国农业部北部研究中心得到，贮存号为NRRLB-15889，见图3)，它们约400对碱基长，在PYM I1的EcoR I末端处连接。作为可选择的标记，PYM I1载体含有一个来自PYM25的2，6千对碱基的Hind Ⅲ-SalⅠ片段。(PYM存在于大肠杆菌宿主，贮藏号NRRL B-18015，见图17)，它是为Saccharomyces的精氨基琥珀酸裂解酶(ARG4基因的产物)编码的。当用EcoRI切割时，PYM I9成为线状，其末端为HIS4基因的侧部片段。
巴斯德毕赤arg4菌株GS190(NRRL Y-18014)是用EcoRI切割的PYM I1转化的，转化成精氨酸原养型(Arg+)。将40微克/毫升补加到再生琼脂培养基以避免对转化体的选择压力，该转化体由于删掉了HIS4基因而需要组氨酸。
在Arg+转化体中选择删掉HIS4基因的HIS-型菌株。为此，将含有Arg+菌落的再生琼脂转到含25毫升无菌水的50ml容积的无菌试管中。用Brinkman Polytron均浆器在刻度5速度下搅碎琼脂约1分钟。通过三层灭菌纱布过滤将酵母细胞与琼脂分开。然后将酵母细胞超声破裂稀释，涂布在含SD培养基及补加40微克/毫升组氨酸的琼脂平板上。
细胞破裂前先稀释到600纳末处消光度0.1，然后用Somifier细胞破碎机350(来自Branson Sonic Power公司)在刻度4处超声破裂10秒钟，它使细胞足以分离又不降低其活性。2-3天后，将在加有组氨酸的SD琼脂平板上生长的菌落影印到另一套SD平板，其中之一是不含组氨酸的。
Arg+HIS-菌落约占总Arg+转化体的0.7%。用Southern吸印杂交法检查三个Arg+HIS-株的基因组DNA。在三个基因组内均缺少了整个HIS4基因，而且直线质粒已被插入(如图2下面所示)。
此外，GS190～PYM I1菌株需要组氨酸，不再需要精氨酸，但没观察到营养需要及生长率的其它变化。
例3从巴斯德毕赤NRRL Y-11430删掉HIS4基因。
图4表示质粒PYMI3a，而图5表示将该质粒的一个片段线性插入到巴斯德毕赤NRRL Y-11430的HIS4位点。载体包含抗G418基因(G418R)，该基因来自PBPG1-1(存在于大肠杆菌宿主NRRL B-18020)，它作为选择标记。G418R基因从质粒PBPG1-1的约2.2千对碱基的BamHI(PBR322点)/BglⅡ(PARS1点)片段上被删去，并插入PYJ8的BglⅡ点(在NRRL B-15889中，见图3)，取代了含毕赤HIS4基因的2.7千对碱基的BglⅡ片段。
用EcoRI酶解载体PYM I3a，产生含G418R基因的一个2，9千对碱基的片段，两侧为分别来自HIS4基因5′和3′端的450和250对碱基的DNA片段。EcoRI切割的质粒被转化到巴斯德毕赤宿主中。
通过在含300微克/毫升抗生素G418培养基上生长能力来选择转化体，所用再生培养基琼脂如例Ⅰ所用，D部分稍加修饰配方如下1.再生琼脂培养基配方a.将9克细菌用琼脂，54.6克山梨醇加入240毫升水中，高压灭菌制成琼脂-山梨醇液。
b.20克葡萄糖加入100毫升水，高压灭菌制成10倍葡萄糖液。
c.10克酵母提取物，20克胨加入100毫升水中，高压灭菌，制成10倍YP液。
d.30毫升10倍葡萄糖液和30毫升10倍YP加入240毫升融化的琼脂-山梨醇液。在55～60℃下融化再生培养基。
2.制备转化体平板，样品制备转化体样品前至少30分钟，将含600微克/毫升G418的再生培养基琼脂每平板倾入10毫升。当转化体样品在SOS液中，在45～50℃水浴中，向每试管倾入10毫升不含G418的再生培养基琼脂。转化样品制备好，将部分样品加入到含再生琼脂的试管中，再一同倾入底部有10毫升含G418琼脂层的平板。将倾入样品的平板放在30℃下温育3-5天。
在含G418的再生琼脂平板上形成一些菌落以后，根据它们是否在缺少组氨酸条件下生长来筛选细胞。萃取出细胞，超声破裂，再如例2所述涂布在补加40微克/毫升组氨酸的SD琼脂培养平板上。在30℃下温育2-3天后，将菌落影印到含和不含组氨酸的SD琼脂培养平板上。
G418菌落的约0.1%是HIS(2000个菌落筛选出2个)。Souther吸印杂交试验说明不仅两个HIS菌株基因组删去了HIS4基因，如图5所示的含G418R基因的两个基因组也删去了HIS4基因。其中一个HIS4菌株，试验室命名为KM31(贮存在美国农业部北部区研究中心，贮存号NRRL Y-18018)是用一些有HIS4的毕赤菌所含质粒，如PSAOH5成功地转化来的，它进一步证实KM31也是特异地删除HIS4基因菌株。
这是第一次将野生型巴斯德毕赤NRRL Y-11430直接转化(即未首先分离和定性其异养衍生物)。由于它们是用定点插入/删除方法组建的，所以这种HIS4突变株可能有这样的优越性可避免异养毕赤宿主中可能发生的第二次突变，如通过化学诱变剂得到的GS115(NRRL Y-158181)和GS190(NRRL Y-18014)。
通过将来自PYM I3a的EcoRI片段插入到，毕赤基因组的毕赤HIS4基因处不会导致增加大部分的PBR322(在PYM I1插入时发生此情况，见例Ⅱ)。由于大多自我复制的基于ARS的毕赤表达载体诸如PSAOH5(见图9)都主要是由PBR322顺序和毕赤HIS4基因组成的，这些自我复制载体与删除毕赤HIS4的宿主基因上没有同质部分，所以不会频繁整合。
例4破坏第一醇氧化酶基因缺少醇氧化酶基因的毕赤菌株(第一醇氧化酶基因这里用AOX I表示，第二醇氧化酶用AOXⅡ表示)至少有两个原因为人们感兴趣。第一，可借助它研究甲醇对基因表达的调节。例如如例7详述的用AOX1和AOX2基因缺陷的一个突变菌株，证实了是否甲醇或一些其它代谢物(甲醛。甲酸酯等)是甲醇调节基因的直接诱导分子。第二个兴趣是AOX缺陷的毕赤菌株能高水平地表达例5和6详述的异种基因产物。
为破坏AO基因，制造了质粒PYM I7(见图7)。通过将来自质粒PYM25(NRRL B-18015，见图17)含Sacchayomyces ARG4基因的一个2.9千对碱基的BamH Ⅰ-Sal Ⅰ片段插入具BamH Ⅰ切口的p PG4.0(NRRL B-15868，见图16a，表示该质粒毕赤部分的限制酶切图)。插入导致从AOX1基因的5′端部分删去600对碱基(约该基因的四分之一)。用pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ酶解质粒PYM I7使其线性化，通过选择Arg原养型转化到PPF1中(Arg4his4，NRRLY-18017)。萃取转化体，如例2所述使细胞超声破裂，再涂布到含0.1%葡萄糖(不是2%)和40微克/毫升组氨酸的SD琼脂培养基。所得菌落影印到一套含下列碳源的SD琼脂培养平皿(内含组氨酸)∶1)无碳源;2)0.5%甲醇和3)20%葡萄糖。约有81.0%的Arg菌落不能正常生长在甲醇上。从两个不能利用甲醇菌株的基因纯DNA的Souther吸印分析即菌株KM71和KM72，证实了这些菌株的AOX1基因被破坏，载体如图8下面所示被插入。
具有基因型his4 aox1∶∶SARG4的PPFⅠ-PYM Ⅰ7醇氧化酶缺陷株的组建具有重大潜在价值。例如由于该菌株是his4，含有HIS4作为选择标记的毕赤载体如PSAOH5(NRRL B-15862，见图9)可如下面例5详述的方法，转化它的宿主。
例5毕赤的一个醇氧化酶缺陷突变株的lacz基因甲醇调节的表达本例描述例6制备的毕赤宿主KM71(一个PPF1-PYM Ⅰ7醇氧化酶缺陷工程菌株)的lacz基因表达试验。
作为对比试验的AOX1宿主是KM71(his4 aoxl∶∶SARG4)，而AOX1+宿主是PPF1(Arg4 his4;NRRL Y-18017)。转化到两个菌株的AOX1 LacE启动子表达盒区是在质粒PSAOH5上(见图9，NRRL B-15862)。从两个菌株中分离出一些His+转化体。它们的基因组DNA是用Southern吸印分析检验的，得到一套含PSAOH5的菌株，PSAOH5被整合在AOX1被启动子位点。与此相似的是，通过选择组氨酸原养型在质粒PT76H的二羟丙酮合成酶(DAS)启动子-LacZ基因融合(见图18，NRRL B-18000)，转化到KM71和PPF1中。
首先将这四个菌株之一培养在SD培养基中，只是2%甘油作为唯一碳源和能源而不用2%的葡萄糖。然后离心收集，分别转移到不同培养基即0.5%甲醇作为唯一碳源的SD培养基。这些培养物作为样品测定β-半乳糖苷酶，结果示在表Ⅰ
表Ⅰ时间 β-半乳糖苷酶 单位/微克＊(小时) AOX1+宿主 AOX1-宿主启动子 AOX1 DAS AOX1 DAS0 0 0 0 02 3 2 5 44 11 8 7 710 18 9 12 1116 17 - 26 -20 21 12 38 1825 - 16 - 2430 18 - 43 2732 - 22 - 3742 14 - 72 -50 - 22 - 4854 14 - 48 -＊β-半乳糖苷酶试验A.所需溶液
1.Z-缓冲液 最后浓度Na2HPO4·7H2O 16.1克 0.06MNa H2PO45.5克 0.04MKCl 0.75克 0.01MMg SO4·7H2O 0.246克 0.001M2-硫基丙醇 2.7毫升 0.05M加水至1升 PH应为72.邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)将400毫克ONPG(sigma N-1127商品号)溶在100毫升蒸馏水中制成4毫克/毫升ONPG溶液。
B.试验步骤1.从600纳米处20-50光密度的培养液中取出一部分，离心并用冷无菌水洗涤。
2.向细胞沉淀加1微升40%Z缓冲液和0.2微克用酸洗的0.45-0.50毫米玻璃珠。将所有样品保存在冰上。高速旋涡搅动样品四次，每次一分钟。每次搅动之间至少放在冰上一分钟。
3.将溶胞产物转入微离心管，在4℃下离心5分钟。将上清液再转入一个新的微离心管，将提取物放在冰上。
4.提取物中总蛋白的浓度是用Bio-Rad实验室(Bradford)蛋白测定法测定的。为此，用四倍无离子水稀释Bio-Rad染色剂，并用3MM的惠特曼(Whatman)滤纸过滤。将100微升Z缓冲液中含3，10，30和100微克牛血清蛋白的溶液加到内含2.5毫升染色剂的一套13×100毫米玻璃管中以制备标准浓度曲线。将样品混合，放置室温下5分钟，测定它们在595纳米处的光密度。将3，10和30微升的提取物样品加入Z缓冲液至100微升，如上所述测定其蛋白含量。用BSA浓度曲线推断每个提取物样品的蛋白浓度。
5.为测定β-半乳糖苷酶，将10微升10倍的提取物稀释液加入到毫升的Z缓冲液中，在30℃下温育5分钟。
6.加0.2毫升4毫克/毫升的ONPG起动反应，旋涡搅动。
7.在各适当时间点加0.5毫升1MNa CO溶液以终止反应(通常在1到30分钟之间取点，在A420＜1处)。
8.读在420纳米处上清液的消光度。
C.计算β-半乳糖苷酶活性单位1U＝在PH7，30℃下每分钟形成1纳摩尔的ONP所需的β-半乳糖苷酶量。
比色杯1cm厚时，1纳摩尔的ONP在420纳米消光度为0.0045;因此，420纳米时消光度为1代表ONP浓度为222纳摩尔/毫升或378纳摩尔/1.7毫升，(因为待分析的上清液总体积为1.7毫升)。表内表示的单位数按下式计算的U＝ (A)/(t(分)) ×378四个培养液中每一个在甘油生长期都几乎没测出β-半乳糖苷酶的活性。转到甲醇培养基后约10～20小时，AOX1+宿主中含有AOX1-LacZ和DAS-LacZ表达区的两个培养液中每微克蛋白中的β-半乳糖苷酶活性均超过约20单位。然而，AOX1本底中的AOX1-LacZ区显示了约60单位/微克的活性。AOX1宿主中的DAS-LacZ区也显示了β-半乳糖苷酶活性的增加。因此，转化了的AOX1宿主，KM71以比转化的异属AOX1菌株PPF-1高2-3倍的水平表达β-半乳糖苷酶。
例6插入乙肝表面抗原基因，删掉AOX1基因在这个定点插入/删除实施例中，整个AOX1基因的编码顺序被删去了，在仍存在于基因组的AOX1基因启动子控制下插入乙肝表面抗原。为组建巴斯德毕赤宿主，创造了质粒PBSAGI5 Ⅰ(该质粒存在于大肠杆菌，贮存在美国农业部比部区研究中心，专利公开后公众将不受限制地获得，贮存号为NRRL B-18021;见图12)。该质粒含1.0千对碱基的一个片段，位于AOX1基因的5′端，紧跟乙肝表面抗原序列和AOX1的3′端300对碱基的片段，各片段位置见图9，10和11。表达区后为2.7千对碱基毕赤HIS4基因编码区片段，最后是一个1.5千对碱基含AOX1基因3′端顺序的PVuⅡ片段。当用BglⅡ酶解PBSAG I5 Ⅰ时，释放出一个7.2千对碱基的直线载体，它在一端含5′-AOX1基因0.85千对碱基的片段，在另一端含3′-AOX1序列的1.1千对碱基的序列。通过选择组氨酸原养型，用BglⅡ切点的PBSAG I5 Ⅰ转化GS115，将转化体从再生琼脂中提取出来，如例2超声破胞，再涂布到含0.1%葡萄糖(而不是2.0%)的SD琼脂培养平板，将得到的菌落影印到用下列碳源的基本琼脂培养基1)无碳源，2)0.5%甲醇，和3)2%葡萄糖。平均有32%的菌落不能正常生长在甲醇上。
Southern吸印分析两个不能利用甲醇菌株的基因组DNA表明AOX1基因已经被删去，而载体顺序如图13所示被插入。
当在甲醇上生长时，GS115-PBSAG I5 Ⅰ菌株(aoxl∶∶HBs Ag-HIS4)比用同样方法转化的醇氧化酶完全感受细胞以高得多的水平表达乙肝表面抗原。
例7用定点插入技术测定巴斯德毕赤的第二醇氧化酶基因。
通过下列观察可推断第二醇氧化酶的存在1)将AOX cDNA或一个基因组DNA作为探针与限制酶酶解的毕赤基因组DNA杂交的Southers吸印图表明至少有两个带;2)起始分离两个彼此相似又不相同的毕赤基因组DNA片段;和3)诸如KM71和GS115-PBSAG I5 Ⅰ，其中第一AOX基因(AOX1)被删除和破坏的突变毕赤菌株仍然可以生长在甲醇上并具有醇氧化酶活性。这些AOX-菌株生长在甲醇上，细胞的生长率及AOX活性比异属AOX1+菌株低得多。因此，似乎第二AOX基因(AOX2)以较低水平表达或者它的产物在甲醇上活性较低。在例4中，pPG4.0中的毕赤DNA片段含AOX1基因。表明p PG3.0的基因组DNA片段含有至少AOX2基因一部分的最可信的方法是通过组建一个假定AOX2基因被破坏或被删除的突变株。为此，组建了定点突变载体pYM Ⅰ12a(见图14)，该质粒首先包括含位于一个3.0千对碱基BamH Ⅰ片段上假定的AOX2基因的p PG3.0(见图16b)。从PY J8(见图3，NRRL B-15889分离出含毕赤HIS4基因的一个2.7千对碱基的BalⅡ片段，并将其插入到BglⅡ和p PG3.0最左边的Kph Ⅰ点。(在插入前用一个寡核苷酸连接物将Kpn Ⅰ点转化成一个BglⅡ点;在插入到pPG3.0前通过填入破坏HIS4基因的BamHⅠ位点)。比较AOX1和假定的AOX2基因(见图16)表明这种组建将导致从AOX2中部删去约800对碱基。用BamH Ⅰ酶解PYM Ⅰ12a，释放出含HIS4-基因片段的一个4.5千对碱基的线性载体，侧部分别是1.1和0.7千对碱基的假定的AOX2位点的顺序。
用这个线性载体转化AOX1菌株，KM71(aox1 his4∶∶SARG4)，选择组氨酸原养型以分离转化体。再通过影印到一套琼脂平板上从其利用甲醇的能力来进一步筛选转化体。
未转化的AOX1-菌株KM71在甲醇平板上生长的很慢，因此如果甲醇包含在琼脂内，观察到可观的菌落生长前，它都已挥发了。这个问题可通过将甲醇以蒸气态喂给菌株来解决。为实现该步骤，在琼脂培养基不含碳源的平皿盖下置入约0.2毫升的100%甲醇。将平板放在室温下，每2到4天用含新解甲醇的平皿盖替换原来的盖。约1-2周后，野生型(AOX1+AOX2+)，突变株(AOX1-AOX2+)和(AOX1-AOX2-)在甲醇上生长明显地不同。
蒸气态喂入步骤后，发现有约0.1%来自AOX1菌株的His+转化体不能在甲醇上生长。用Southern滤纸杂交法分析来自八个AOX1-AOX2-His+转化体的DNA。其中三个含如图15插入约线状PYM Ⅰ12a载体。用一个AOX1-AOX2-双突变，KM7121(NRRL Y-18019)分析表明该菌株绝对不能在甲醇上生长，该菌株也无AOX活性。由KM7121的结果清楚地知道pPG3.0中的毕赤片段不含来自第二AOX基因的顺序及除这两个醇氧化酶的其它序列，也不含其它存在于巴斯德毕赤的氧化甲醇活性。
山怫例子仅用来说明本发明的实施，将不限制本发明及其权项。不偏离本发明本质及构思的合理的改变和修饰也在本专利的保护范围内。
权利要求
1.毕赤属酵母定点选择性修饰基因组的方法，修饰是在预选决定的基因组内定点进行的，其方法包括用系列排列的线性DNA片段转化毕赤属宿主菌株，该片段包括一个第一插入的DNA片段，一个可选择的标记基因，和一个第二可插入的DNA片段，其中所说第一和第二可插入DNA片段均是一个至少约200个核苷酸片段，它具有与原来的毕赤各种基因组发生修饰的位点的个别部分同质的核苷酸序列；其中所说的第一和第二可插入DNA片段在直线DNA片段中是一个接一个与原来在毕赤基因组同样的方向排列的；和其中所说的标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。
2.根据权利要求
1的方法，所说第一和第二可插入DNA片段选自一组包括长约200-5，000个碱基对的片段，它们分别是醇氧化酶基因，二羟丙酮合成酶基因，精氨基琥珀酸裂解酶基因，和组氨醇脱氢酶基因。
3.根据权利要求
2所述方法，其中所述第一和第二可插入DNA片段是由图1所示的限制酶切图定性的。
4.根据权利要求
2所述方法，其中所述第一和第二可插入DNA片段是由图4所示的限制酶切图定性的。
5.根据权利要求
2所述方法，其中所述第一和第二可插入DNA片段是由图7所示的限制酶切图定性的。
6.根据权利要求
2所述方法，其中所述第一和第二可插入DNA片段是由图12所示的限制酶切图定性的。
7.根据权利要求
1所述的方法，其中所述第一和第二可插入DNA片段是由图14所示的限制酶切图定性的。
8.根据权利要求
1所述的方法，其中所述线性DNA片段进而包括一个异种基因，这异种基因及可选择标记基因均位于第一可插入DNA片段和第二可插入DNA片段之间。
9.根据权利要求
1所述的方法，其中所述线性DNA片段进而包括一个调节区，和一个异种基因;其中所述异种基因是该调节区调控下的;其中的异种基因调节区及所述可选择标记基因位于第一可插入DNA片段和第二可插入DNA片段之间。
10.根据权利要求
1方法制备的突变毕赤菌株，所述菌株基本上是巴斯德毕赤(GS115-p BSAG I5 I)的纯培养物。
11.根据权利要求
1方法制备的突变毕赤菌株，所述菌株基本上是巴斯德毕赤(GS190-PYM I1)的纯培养物。
12.根据权利要求
1方法制备的突变毕赤菌株，该菌株基本上是巴斯德毕赤NRRLY-18018(NRRL Y-1430-PYM I3a KM31)的纯培养物。
13.根据权利要求
1方法制备的突变毕赤菌株，该菌株基本上是巴斯德毕赤(PPF1-PYMI7KM71)的纯培养物。
14.根据权利要求
1方法制备的突变毕赤菌株，所述菌株基本上是巴斯德毕赤NRRLY-18019(PPF1-PYM I7-PYM I12a;KM7121)的纯培养物。
15.系列排列的线性DNA片段，包括一个第一可插入的DNA片段，一个可选择的标记基因，和一个第二可插入DNA片段;其中所述第一和第二可插入DNA片段均是一个至少约200个核苷酸片段，它具有与毕赤属各种基因组DNA某部分同质的核苷酸顺序;其中所述第一和第二可插入DNA片段在直线DNA片段中是一个接一个接一个与原来在毕赤基因组同样的方向排列的;和其中所述的标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。
16.根据权利要求
15的一个线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入DNA片段选自一组包括长约200-5，000个碱基对的片段，它们分别是醇氧化酶基因，二羟丙酮合成酶基因，精氨基琥珀酸裂解酶基因，和组氨醇脱氢酶基因。
17.根据权利要求
16的线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入片段是由图1所示的限制酶切图定性的。
18.根据权利要求
16的线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入片段是由图4所示的限制酶切图定性的。
19.根据权利要求
16的线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入片段是由图7所示的限制酶切图定性的。
20.根据权利要求
16的线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入片段是由图12所示的限制酶切图定性的。
21.根据权利要求
16的线性DNA片段，其中所述第一和第二可插入片段是由图14所示的限制酶切图定性的。
22.根据权利要求
15的线性DNA片段，其中所述线性DNA片段进而包括一个异种基因，其中所述异种基因及所述可选择标记基因均位于第一和第二可插入DNA片段之间。
23.根据权利要求
15的线性DNA片段，其中所述线性DNA片段进而包括一个调节区，和一个异种基因;其中所述异种基因是在该调节区的控制下;其中的调节区-异种基因及所述可选择标记基因位于第一和第二可插入DNA片段之间。
24.根据权利要求
15的线性DNA片段，其中所述线性DNA片段进而包含细菌质粒DNA。
25.一个包含权利要求
15的线性DNA部分和细菌质粒DNA的闭合环状质粒;其中所述细菌质粒DNA位于第一和第二可插入DNA片段之间。
26.制备多肽的方法，包括培养用一个强天然动子-为所制备多肽编码的表达区顺序转化的宿主酵母株，培养基营养条件需要限制，并含诱导强天然启动子的物质。
27.根据权利要求
26的方法，其中所述营养限制条件是通过应用一个不能合成在含所述诱导物质培养基上非限制生长所需基因产物的酵母作为宿主菌株来提供的。
28.为巴斯德毕赤及其突变体和功能相当的菌株的AOX2基因编码的DNA片段。
29.根据权利要求
28的DNA片段，其中所述AOX2基因是由图16b所示限制酶切图定性的。
专利摘要
毕赤属酵母定点修饰基因组的方法和所用的新的DNA顺序。用系列排列的线性DNA片段转化毕赤。该片段包括第一和第二可插入DNA片段，侧部为一个标记基因。可插入的DNA序列与毕赤基因组的特定部分是同质的，在定点通过重组整合。得到的转化宿主含标记基因和任何位于可插入DNA片段间的附加DNA序列。它定点破坏或删去了原有序列。当用醇氧化酶被破坏的宿主时，将加强异质基因的表达。毕赤的第一醇氧化酶基因破坏时，发现还存在第二醇氧化酶基因。
文档编号C12N1/16GK86107108SQ86107108
公开日1987年6月3日 申请日期1986年10月24日
发明者詹姆斯·迈克尔·克里格 申请人:菲利普石油公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan