专利名称:稳定的α-淀粉酶溶液的生产方法及由此生产的液体α-淀粉酶的制作方法
本发明涉及制造含有从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)而来的α-淀粉酶以及一种淀粉，最好是麦芽糖糊精的一种实际上稳定的溶液状的酶产物。
酶是生物催化剂，它们调节着许多本来就出现在生命有机体里的生化反应。酶用于像制革，去污剂，食品及医药工业之类的许多领域。在生产酶的传经方法里，酶的沉淀物是溶在水里的。然而，高效的在水里的酶溶液(具有高的酶活性的浓缩溶液)会在贮存中不稳定;酶从溶液沉淀出来以及/或是对热敏感的。美国专利3，242，056号揭示了使用多羟基化合物溶液来协助防止溶菌酶的不耐热性。美国专利4，497，897号揭示了从含有丙烯甘醇，钙离子及羧酸盐的嘉氏伯枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin Carlsberg)而得到的一种稳定的液相蛋白酶。美国专利4，519，934号揭示了从散布在丙烯甘醇里的地衣芽孢杆菌而得到的一种稳定的液体α-淀粉酶。
一种含有从地衣芽孢杆菌而得到的α-淀粉酶的液体酶产物呈水溶液是合乎需要的，因为它能直接用于工业上，就像液体去污剂要先把干的酶沉淀物再溶在水里并无不便之处以及/或排除了有关溶剂(即丙烯甘醇)的混溶性。同时避免了干产物发出的酶灰。因此，研究人员一直在寻找把酶保持在水溶液里的方法，特别是保持在高效(高度浓缩的)溶液的方法。尽管前面段落所说的已有技术指出用了各种溶剂(例如丙烯甘醇)，但从来未曾获得一种水相的具有高酶活性的保留在溶液里的酶产物。
例如，α-淀粉酶能够在一个适宜的营养培养基里培养像枯草牙孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌之类的各种不同的微生物而获得。枯草芽孢杆菌产生的α-淀粉酶在物理上是稳定的，即是说，甚至在活性是3百万MWU/ml(改良Wohlgemuth单位/毫升)或更高时，这种酶仍不会在水溶液里明显地沉淀出来。然而，这些α-淀粉酶溶液对热是敏感的，加入麦芽糖糊精以增加耐热性。Klesov等人在国立莫斯科大学化学系“生物化学”杂志上，(Vol.44(6)p.1084-92(1979))发表的“可溶的及固相的葡糖淀粉酶的底物耐热性作用”一文里类似地揭示了从黑曲霉(Aspergillus niger)而得到的葡糖淀粉酶以麦牙糖糊精所起的耐热性作用。另一方面，从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶是耐热的(参看Volesky等人在微生物的酶生产纯化及分离“微生物酶”Vol.2.lssue 2，p.120，1985))的实例)，但它在高浓度的水溶液里在物理上不是特别稳定的。
本发明提供了一个如下的方法。在与用地衣芽孢杆菌的发酵提供一种从发酵而来的含酶的和含有固相废产物的发酵肉汤而生产耐热的α-淀粉酶相结合方面，本改进包括a)在发酵肉汤里加入一种淀粉，当加到足量时，它就会防止酶与酶结块，从而增大了α-淀粉酶在水溶液里的溶解度。
不管怎样，没有任何文献提出或揭示本发明的用淀粉来制备具有高酶活性的水相产物，其中酶是从地衣芽孢杆菌而得到的耐热α-淀粉酶，因为研究了加淀粉对高达大约1，000，000MWU/ml活性的α-淀粉酶水溶液耐热性作用的影响。
相应地，本发明的目的是提供一个实际上稳定的α-淀粉酶溶液的配方，其中α-淀粉酶是从地衣芽孢杆菌而得到的。所谓“实际上稳定的溶液”是指酶留在溶液里是有利的，因为当溶液够浓时，即有高的酶浓度时，其中的活性起码是350，000MWU/ml时利于阻止酶从溶液里沉淀出来。借助调节淀粉的量，就能获得具有活性在1，000，000MWU/ml或更高的各种浓度的溶液，这些溶液实际上是稳定的溶液。
本液体配方可含有除从地衣牙孢杆菌而得到的耐热的α-淀粉酶以外的他种地方酶以及/或蛋白酶。产生淀粉酶以及/或蛋白酶的各种微生物包括，但不局限于枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，以及解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。本配方还企图最好在去污剂上使用，而这样可含有从两性的、阴离的、阳离子的、非离子的、两性离子的或中极性非离子的表面活性剂或它们的混合物的基团而来的大约0%至大约80%的去污剂表面活性剂。这样的去污剂是人所熟知的，而且对本液体酶配方有用的一些去污剂的实例就是在美国专利4，318，818号(Letton等人)及美国专利4，111，855号(Barnat等人)所说的实例，它们所揭示的在这里都作为参考资料。
下表说明与一般生产方法相比的一个最佳实施例。这表只想起到说明问题的目的，而不看成是用来指导如何实施本发明的。
表A发酵(菌体分离)B培养滤液(PM-2微孔薄膜)C超滤浓缩(D)(ⅰ)或(D)(ⅰ)用沉淀法 用真空蒸发法获得滤饼 获得浓缩溶液(E″)(ⅰ)或(E″)(ⅱ) (E)(ⅰ) (E)(ⅱ)从水中的滤 连续蒸发 从含淀粉水中 以加淀粉固化饼抽提酶 的滤饼抽提酶(调pH至8，置 pH6.510℃中18-24小时)(过滤)(F′)酶滤饼产物 (F)液体终产物(G)从含淀粉水中的滤饼抽提出酶上表说明了生产实际上稳定的高效能的水相α-淀粉酶制品的一个简要方法。这个方法包括(A)进行发酵，(B)通过过滤从含有酶的发酵肉汤里分离出菌体，(C)超滤而得到酶的浓缩液，(D)或是(ⅰ)沉淀出含酶的滤饼或(ⅱ)进一步用真空蒸发浓缩或用附加的超滤浓缩，然后(E)或(ⅰ)通过在溶液里重行浆化滤饼或用循环溶液通过滤饼，从中抽提出含淀粉溶液，或将淀粉加到抽提液里，或(ⅱ)直接加淀粉到浓缩液里以获得(F)一种含有终产物的淀粉水溶液。在常规过程里(E′)步由(ⅰ)在水中浆化滤饼从中抽提出酶，或由(ⅱ)连续蒸发而代替。然后，一个含酶的滤饼重行沉淀，而且滤出多余的母液而剩下干的酶产物(F′)。另外，本发明能够在(E′)及(F′)步之后通过从这个滤饼抽提出酶进入含有淀粉的水溶液而完成(G)。
在酶产生以后，固体物(发酵而得到的菌体)可通过像过滤以及/或离心等标准技术，从全发酵肉汤里除去而提供出一种含酶的溶液。紧接着是含酶的无细胞溶液最好通过像超滤以及/或蒸发之类的任何浓缩方法浓缩成大约1到10倍之间。将一种淀粉或含有淀粉的一种水溶液加到这种溶液或浓缩液里，使淀粉对含酶溶液或浓缩液的量大约在0.1%～50%W/V(重量/体积)之间如在3%～15%W/V就更好。
在一个理想的实施例里，加入淀粉之前可将一些沉淀剂加到无细胞的含酶溶液(或浓缩液)里，以引起含有这种酶的滤饼沉淀出来。大家熟知的沉淀剂是像甲醇，乙醇，异丙醇，1-丙醇，正丁醇，叔丁醇以及它们的混合物之类的低分子量有机溶剂，或者是像硫酸钠，硫酸铵，以及它们的混合物之类的盐类。滤饼一词在此认为应含有“浆”一词在内以包括滤饼湿到可称为浆的那些例子。如果有多余的母液，它能够通过用通常的过滤，抽滤，重力沉降或离心之类的若干种方法中的任一种从这种浆或滤饼里去除之。然后，可以配制在水中含有大约0.1%～50%W/V(大约3%～15%就更就好)淀粉的一种水溶液，并用它来溶解或从滤饼中抽提出酶。这种从滤饼抽得酶的抽提法也可用水进行，然后加淀粉到抽提液，使其量达到大约0.1%～50%W/V。
在另一个实施例里，固体废产物(即从发酵而得到的菌体)在产生酶之后并不从发酵肉汤里分出。相反地，直接加淀粉或淀粉水溶液到全发酵肉汤里，这有助于把酶保留在溶液里，以便在除去固体废产物时随之而失的酶少些。淀粉必须加到其量在全发酵肉汤里占大约0.1%～50%(重量/体积)。
任何淀粉都可用于本发明，这意味着亦包括像乙酰化淀粉或甘醇酸酯淀粉之类的衍生淀粉。这种淀粉也许是作为酶的底物。酶通常在高温，即像60℃里表现出它们的最大活性。除非加热否则它不会明显地作用于底物上。更特别地，地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶，它在温度升到40℃左右时实质上才开始水解淀粉底物，温度达到60℃左右时，实际上发生水解。因此，在平常的室温贮存条件，淀粉底物不会明显地降解。在本发明里，较好的淀粉底物是玉米糖浆及麦芽糖糊精。特别好的是麦芽糖糊精。麦芽糖糊精的货源是MALTRIN
，例如它是一种水解的玉米产物(谷类实体)，它是由衣阿华州的Muscatine的谷物处理公司按不同的右旋糖当量供应的。MALTRIN是一种乏味的，白色食用的，具有十分理想的发泡性能的碳水化合物。它的甜度低，完全可溶于水且可防结块。
例如，MALTRIN-100一个典型的分析结果是典型的理化数据右旋糖当量 9.0～12.0含水，%最高是 6.0pH，20%溶液 4.0～4.7形状 白色粉末典型的碳水化合物测定结果(按干重计)单糖 1% 三碳糖 6% 戊糖及超过五个碳的糖84%双糖 4% 四碳糖 5%人们发现麦芽糖糊精的浓度在大约3%～15%W/V时是最有利于把酶保留在溶液里的。
而且已惊奇地发现麦芽糖糊精的右旋糖当量(DE)和保持酶加溶作用之间有一负相关关系。即是说，麦牙糖糊精右旋糖当量越低，就有更多的酶趋向于留在溶液里。最好这种(DE)是大约35或更少一些，少于大约25就更好。这一发现在后面实施例Ⅳ里阐述。
具有其它右旋糖当量的其它淀粉亦可以有利地利用。其确切的机理仍未了解，但从理论上说，由于形稳定的酶/底物这一复合体，任何淀粉都可使用。
在这个较好的实施例里，加入淀粉之前或后，将含酶溶液的pH调至酶的等电点水平或高于这个水平。这个pH应处于大约在等电点以上4.0pH单位和下至等电点的范围里。pH最好是在等电点以上不超过大约3.0单位。α-淀粉酶的等电点变动于4.8和5.5之间，在这一酸性pH里，酶将保留在溶液里。然而保持这么低的pH值，对于贮存α-淀粉酶溶液是不可取的，因为这种酸性会使酶变性。在最好的实施例里，其中的酶是TAKA-THERM
(由印第安纳州，Elkhart矿冶公司实验室供应)。它是一种耐热的从地衣芽孢杆菌一个突变品系的发酵而得到的α-淀粉酶，pH应在大约5.5和9.0之间，最好是在大约6.0和8.2之间。人们已发现在具有TAKA-THERM的较理想的实施例里用的最适宜pH大约在6.5和8.0之间。调pH的较理想的试剂是酶化学这个领域里熟知的，其例是像氢氧化钠和氢氧化钾之类的碱以及像盐酸和醋酸之类的酸。
在各实施例中α-淀粉酶活性的量度是以液化α-淀粉酶分析手册(Manual of Liquefying Alpha-Amylase Assay)介绍的一种改良Wohlgemuth，在生物化学29∶1(1908)指示的方法进行的，它是以淀粉-碘复合物兰度减弱确定可溶性淀粉的水解度测量的。在一次典型的操作里，5毫升pH为5.4缓冲的2%可溶性淀粉及4毫升水与1毫升适当稀释的酶一起在保持40℃的水浴中培养。按时间间隔(从加入酶起5～30分钟)倒出各等分试样(1毫升)并注入一有5毫升稀碘液的试管里靠倒量而相混和。随后在比色计里比色以监视这反应达到终点。酶的活性是计算成每毫升含改良Wohlgemuth单位(MWU/ml)。
一改良Wohlgemuth单位(MWU)是指在分析条件下30分钟内糊精化1毫升可溶性淀粉成为规定兰色数值。为了计算，假设其密度是水的密度，因而每毫升的活性就被假定是相当于每克的活性。其计算是MWU/ml＝MWU/g＝ (100×3)/(TXW) 3000/(TXW)式中100＝每次培养混合物时的淀粉，毫克30＝规定糊精化时间，分T＝到达终点所需时间，分W＝在1毫升酶稀释等分样品里加于培养混合物里的酶重量克。
使用麦芽糖糊精作淀粉底物的α-淀粉酶在高浓度时其稳定理论示意表达如下。已经意外地发现低溶液中游离酶浓度的因素亦在酶活性高时妨碍酶的凝结。从稀酶溶液里除去水份有利于让酶与酶相作用来代替酶与水相作用。因此增加酶与酶相作用便会引起这些酶通过非共价引力相缔合最后导致酶沉淀。
n(E)→(E)n→凝聚→沉淀↓ ↓水 水已经发现在酶的抽提液里或当酶浓缩时加入淀粉(S)就防止了酶在高浓度时不溶解，正如以下方程式所表达一样。
n(E)+m(S)→(ES)x+S(n-m)+En-x如n＞m时平衡时，溶液里通常包含有X克分子的酶/淀粉复合物(ES)，”淀粉(Sn-m)及游离酶(En-x)这一实验数据表明，在无任何淀粉时，当游离酶(En-x)的浓度超过350，000MWU/ml以酶在溶液里的重量为准的活性时，酶就出现沉淀。
在后面各实施例里阐述的那些实施例都使用TAKA-THERM，一种从地衣芽孢杆菌而得到的耐热α-淀粉酶，而并不在此限止本发明。
适于培养地衣芽孢杆菌一个品系以生产耐热α-淀粉酶的发酵培养基可按下表配剩以供1000立升发酵罐用。
CaCl22H2O(薄片) 0.2～1.0公斤KH2PO4+K2HPO415～24公斤(NH4)2SO42～7公斤合适的碳源 100～200公斤棉籽粉 25～140公斤大豆基(大豆粉) 30～50公斤Mazu DF6000＊ 8～13升水 加至总量 1000 升＊由Mazu公司供应的一种有机去泡剂，其主要成份是聚丙二醇和聚硅氧烷。
将地衣芽孢杆菌菌株的活细胞接种到这个培养基里，并让它在维持于近似中性pH的40～50℃下发酵70～90小时，这样发酵后，用适当的絮凝剂絮凝培养基以助除去菌体。菌体也可用像离心或过滤的方法来除掉，而液体通过一滤鼓澄清，从而提供一无细胞的溶液(初级培养液或上清液)。这种滤鼓一般是预先用像Superaid的助滤剂涂过以澄清(即净化)这种初级培养滤液或上清液。
在一个较理想的实施例里，这种初级培养液也可用像PM-10微孔滤膜(断流分子量10000)以及/或真空之类的超滤来浓缩。因而，酶可通过加入20%W/V硫酸钠，28%W/V硫酸铵或80%(V/V)乙醇而较好地且定量地从浓缩的培养滤液里沉淀(pH6～8)成含酶滤饼的形式。接着用水从滤饼中抽提酶，并将麦芽糖糊精加到抽提液里。
实施例Ⅰ如前所述，将通过涂有Superaid的滤鼓净化了的α-淀粉酶初级培养滤液，用Romicon20-HF-4过滤器装上断流分子量10，000的微孔滤膜在10℃下超滤浓缩7倍，并把它分为若干等分样品。每一等分样品的pH用20%W/V的氢氧化钾水溶液调至7.6。然后，按不同的百分比W/V把Maltrin-20加到几个样品里充分地搅拌使它们均匀混和。留下一些样品(0%W/V Maltrin-20)作对照。紧接着，每个样品都进一步在35℃下用旋转蒸发器(Brinkman-Buchi Rotovapor
)真空浓缩成对特定的样品具有理想的淀粉酶活性和满意的Maltrin浓度。所有的样品都加入0.5%W/V的山梨酸钾酯来防止微生物污染。接着在25℃下贮存1个月。到指定日期后，把这些样品离心。其酶量(是起始量、留在上清液里的量或是沉淀了的量)能像前述那样通过测定MWU/ml活性而确定。例如，测出在上清液中的酶量，并用酶的起始量减之就得到损失在沉淀里的酶量。这个量可用公式100×(沉淀酶量/起始酶量)换等成沉淀酶的百分比。它们的结果归纳在下列表Ⅰ里。
表Ⅰ在25℃下贮存1个月期间Maltrin-20对α-淀粉酶沉淀程度的影响样品号 起始量MWU/ml Maltrin-20浓度(%W/V) 沉淀酶%1 1，043，478 0.00＊ 93.52 1，043，478 2.11 28.53 960，000 3.70 37.84 1，043，478 6.34 25.65 1，180，378 7.40 -6 779，721 0.00＊ 88.87 789，474 2.6 79.48 845，522 5.4 16.49 895，522 9.0 17.610 845，070 11.4 25.411 845，070 13.6 22.012 716，418 0.00＊ 85.213 872，727 2.38 21.014 979，592 4.54 68.815 786，885 6.25 16.716 786，885 8.33 17.817 872，727 11.36 25.018 640，000 0.00＊ 80.919 551，724 2.2 71.120 578，313 4.2 39.821 578，313 5.73 54.022 516，129 8.00 14.423 558，140 10.00 15.1
表Ⅰ(续)样品号 起始量MWU/ml Maltrin-20浓度(%W/V) 沉淀酶%24 470.588 0.00＊ 54.825 452，830 2.1 68.226 452，830 4.2 45.227 470，588 6.3 14.228 452，830 8.4 14.329 489，796 11.25 15.430 369，231 0.00＊ 56.031 421，053 2.74 14.032 406，780 4.25 12.733 380，952 6.57 14.534 380，952 8.76 13.035 393，443 10.96 11.9＊样品1，6，12，18，24及30是对照。
列于表Ⅰ的结果表明，在浓的培养滤液里Maltrin阻止了酶沉淀。然而就如同在后面实施例Ⅲ所说的较好的实施例一样这些酶在高效的溶液里是不能维持的。
实施例Ⅱ除浓缩、调节pH，以及加Maltrin的顺序不同外，其它步骤都跟实施例Ⅰ一样。通过超滤以及随后蒸发变成大约700，000MWU/ml这一浓度而把所有的培养滤液浓缩7倍。然后把浓缩液pH调至7.6和把它分成4份，每份加入不同浓度的Maltrin-20。这些样品在25℃下徐徐搅拌40小时，然后离心。损失在沉淀物中酶的百分数是用实施例Ⅰ相同的方法计算的。其结果归纳在下列表Ⅱ中。
表ⅡMaltrin-20在700，00MWU/ml的作用Maltrin-20 沉淀酶(%W/V) %0.00 842.0 744.0 488.0 6.2从上表可见不同量的Maltrin-20，高者达8.0%W/V，证明由于沉淀造成酶的损失急剧下降。然而与下列实施例Ⅲ中较好的实施例一样，这种活性在高效能溶液里不会保持。
实施例Ⅲ按前面说法用PM-10微孔薄膜滤浓缩了4倍，接着又用(20%W/V)Na2SO4沉淀得到的一种α-淀粉酶溶液供本实施例使用。
由于用硫酸钠作沉淀剂，因而将温度加至室温以上，即近30℃，以减轻硫酸钠结块。将助滤剂FW-6(1%W/V)加入并用真空过滤器收集含酶滤饼。从过滤器里将含酶滤饼移出，并在少量水中重行浆化以便将酶从中溶出。过滤这些浆以得出浓缩的酶溶液，然后用水调高起始酶浓度到用测量活性测定是1，000，000MWU/ml处，并进一步将它分为7个等分样品，将Maltrin-250(粉状)分别为1%，2%，3%，4%，5%及10%的量加到6个等份样品里。将一个等样品百作对照(0%Maltrin-250)。加入后，充分搅拌样品使其均匀地混和，而且用氢氧化钾把pH调至8.0，因为加进了Maltrin，起始活性就减弱，即会有Maltrin-250相应量的各个适当的空栏亦准备用来排除任何由于Maltrin对分析起作用而造成的误差。所存的样品都在10℃中贮存24小时。到指定时间后，就过滤各样品。正如前面所说的，酶量是由测定活性来确定的。因此，将在滤液里测定的酶量，从已改准的起始酶量中减去而得出损失在沉淀里的酶。用100×(沉淀酶/改准的起始酶)而把它换算成沉淀酶百分比。其结果归纳在下列表Ⅲ中。
表Ⅲ在pH8.0，10℃中贮存了24小时高起始酶浓度为1，000，000MWU/ml时Maltrin-250对α-淀粉酶的水相稳定性的影响样品号 Maltrin-250的浓度(%W/V) 沉淀酶%1对照 0 802 1 453 2 184 3 05 4 06 5 07 10 0这种水相酶溶液比在前面实施例Ⅰ所说的浓缩培养滤液纯得多，因为硫酸钠沉淀除去了杂物。因此，在溶液里基本上不必用多于3%W/V的Maltrin来保持所有的酶的活性。正如所能见到的那样，当Maltrin-250的浓度是3%W/V或更多时就无酶沉淀，因此以其活性计，100%的淀粉酶留在滤液里。
实施例Ⅳ在此例中除加入Maltrin的量保持不变而其右旋糖当量变化外，其余的都是重复实施例Ⅲ的。因此，研究了麦芽糖糊精的聚合度(DP)在高活性时对α-淀粉酶稳定性的影响。用右旋糖当量不同的麦芽糖糊精1%W/V加到8个含有起始活性为1，000，000MWU/ml的浓的α-淀粉酶等分样品。每个样品的pH都用氢氧化钾调至8.0，而且其活性用加入Maltrin来调准。这些样品在10℃下贮存24小时，到指定时间后，这些贮存过的样品就过滤。其滤液用来分析α-淀粉酶活性并用在实施例Ⅲ里相同的方法计算沉淀酶的百分数。其结果归纳在下表里。
表Ⅳ在起始酶浓度高达1，000，000MWU/ml，贮在10℃24小时下右旋糖当量(DE)对α-淀粉酶的稳定性的影响样品号 淀粉底物 测得的DE 沉淀酶%1 Maltrin-040 5.2 40.02 Maltrin-100 11.4 41.53 Maltrin-150 16.1 41.54 Maltrin-200 22.5 45.55 Maltrin-250 23.6 45.56 Maltrin-365 35.7 51.07 Maltose 68.0 82.08 Glucose 100.0 85.09 对照 无 - 80.6在表Ⅳ的结果表明随着麦芽糖糊精的右旋糖当量(DE)下降，酶的稳定性就增加。在与对照相比时加入麦牙糖或葡萄糖也不会有任何减少沉淀酶的作用，相反地起到微弱增加的作用。
比较实施例A(无Maltrin)本实施例使用了像在实施例Ⅱ所说的以超滤及硫酸钠沉法(20%W/V)而获得的浓的α-淀粉酶溶液。
浓的酶溶液的pH是用氢氧化钾调至pH8.0，然后将这溶液进一步分为三个样品。随后用水调每个样品的酶的起始浓度至分别是1，000，000MWU/ml，700，000MWU/ml及350，000MWU/ml活性。然后三个样品中的每一个再分为四份，并贮存在5℃，10℃，24℃及37℃里18小时。到指定时间后，这些样品用Whatman3号滤纸过滤，在滤液里的酶量是通过测量而算出沉淀酶的百分数。这些结果极导在下表A中。
表A在pH8.0及各种温度下贮存18小时，温度及起始酶浓度对沉淀酶的作用起始酶活性MUW/ml 培养温度℃ pH8.0 18小时后沉淀酶%1.1，000，000 5 81.310 80.025 80.737 75.02.700，000 5 44.310 45.625 41.437 23.83.350，000 5 4.810 7.325 7.337 0.0上表的结果清楚地证明了在没有Maltrin时起始酶与酶沉淀的程度之间的关系。在pH8.0下贮存含有1，000，000MWU/ml高起始活性的酶水溶液18小时导致75-81.3%的酶沉淀，而350，00MUW/ml低起始活性的只导致7.3%或更少的酶损失在沉淀里。换言之，当酶溶液的效能增加时，即该溶液具有较高浓度的α-淀粉酶时，那么就使酶趋向沉淀而不是留在溶液里。
比较实施例B(无Maltrin)在此例中除活性保持不变而pH变化外，其余的都重复实施例A正如在实施例A一样，已用水调成1，000，000MUW/ml高起始活性的浓缩溶液的一个等分样品被分成六个等分样品。各个都用氢氧化钾调至分别为pH5.5，6.5，7.5，8.5，9.5及10.5，并在5℃下贮存18小时。贮存后，这样样品用Whatman3号滤纸过滤，并测定留在滤液里的酶，然后用像实施例A相同的方法计算沉淀酶的百分数。其结果归纳在下表B里。
表B在高起始活性，贮存在5℃，18小时后pH对α-淀粉酶沉淀的影响样品号 pH 沉淀的α-淀粉酶%1 5.5 02 6.5 9.03 7.5 65.04 8.5 80.05 9.5 76.56 10.5 52.0从溶液里沉淀出酶的程度随pH从6.5至8.5的增加而增加，而在pH8.5时达到最大值。pH在8.5以上，就发现损失在沉淀里的酶减少。这也许是在高碱性pH时沉淀了的酶重溶之故。已有趣地注意到，在高起始浓度时，酶的最大溶解度出现在pH5.5处，它是接近这种酶的等电点。然而，如前所述，在长期贮存中，这样的酸性pH会使酶变性。
比较的实施例C(无Maltrin)在pH8.0时温度对α-淀粉酶沉淀率的影响一个含有起始活性1，000，000MWU/ml的浓缩酶水溶液的等分样品，除各自的pH都用氢氧化钠调至8.0以外，其余的都像在实施例B那样分装在两个不同的瓶里(每个样品150ml)。然后，两个样品分别地贮存在10℃或37℃处。从每个瓶里按不同的时间间隔即2.5小时，4小时，7小时，10小时，12小时及20小时每次倒出10ml等分样品。倒出后，每个等分样品立即用Whatman3号滤纸过滤并分析滤液的α-淀粉酶。然后用像在实施例A相同的方法计算沉淀酶的百分数，其结果归纳在下表C中。
表CpH8.0时温度α-淀粉酶沉淀率的影响时间(小时) 沉淀酶%10℃ 37℃2.5 - -4 - -7 36 -10 61 1912 75 4020 80 65表C的结果表明低温利于酶沉淀而37℃利于酶溶解。
在总结关于表A，B，及C时，其结果清楚地证明在溶液里起始酶与在不同pH值及温度下酶损失在沉淀上的程度的相互关系。从酶溶液里除去水，即使之浓缩成高活性的溶液，会引起增加蛋白质与蛋白质的相互作用，这就趋向有利于酶的凝结而导致沉淀。实施例Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ的比较清楚地说明向高活性的浓缩溶液加入Maltrin，阻碍了蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而有利于酶的溶解。
权利要求
1.一种与用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵来提供一种含有从发酵而得的酶及固体废产物的发酵肉汤而生产耐热的α-淀粉酶相结合方法，本发明的改进包括向发酵肉汤里加入淀粉，当加的量足够时，就会阻碍酶与酶结块，从而增进了在水溶液里α-淀粉酶的溶解度。
2.按权利要求
1所述的方法，其中发酵肉汤在加入淀粉之前先行处理去除固体废产物而提供一种无细胞的含酶溶液，淀粉加到这种溶液里由此而提供一种实际上稳定的水溶液，α-淀粉酶产物。
3.按权利要求
2所述的方法，其中(a)是通过把淀粉混和到含酶溶液里，使淀粉含量占溶液体积之比的量从大约0.1%至50%而完成的，其中淀粉是直接把加入或先把淀粉溶在水中再将得到的淀粉水溶液加入。
4.按权利要求
3所述的方法，其中含酶溶液被浓缩大约1至10倍，而且是在浓缩当中或浓缩之后加入淀粉的。
5.按权利要求
4所述的方法，其中在加入淀粉之前或之后，把pH调至从近似该酶的等电点直至近似该等电点以上4.0pH单位范围以内的一点上。
6.按权利要求
5所述的方法，其中水相产物的活性的≥350，000MWU/ml。
7.按权利要求
1所述的方法，其中淀粉是α-淀粉酶的底物。
8.按权利要求
7所述的方法，其中淀粉底物是玉米糖浆或麦牙糖糊精。
9.按权利要求
8所述的方法，其中淀粉底物是具有大约低于35的右旋糖当量的麦芽糖糊精。
10.按权利要求
2所述的方法，其中在除去固体废产物以提供无细胞含酶溶液之后以及在加淀粉之前，这种含酶溶液要加入一种选自一批由盐和低分子量的有机溶剂组成的沉淀剂，以引起含有该酶的滤饼沉淀，随后该酶又从含酶滤饼抽提出来进到(ⅰ)水里，接着加淀粉到这个抽提液里使淀粉重量达到占水的体积大约0.1%-50%，或者抽提而进到(ⅱ)含量淀粉重量占水的体积大约0.1%-50%的淀粉水里。
11.按权利要求
10所述的方法，其中从滤饼抽提酶主要包括循环水或淀粉水溶液通过滤饼或者在水里或淀粉溶液里重行浆化滤饼。
12.按权利要求
10所述的方法，其中在加入淀粉之前或之后，将抽提液pH调至从近似该酶的等电点直至近似该等电点以上4.0pH单位范围以内的一点上。
13.按权利要求
10所述的方法，其中盐类沉淀剂是选自一批包括硫酸钠，硫酸铵及其混合物，而有机溶剂沉淀剂是选自一批包括甲醇，乙醇1-丙醇，异丙醇，正丁醇，叔丁醇及其混合物。
14.按权利要求
10所述的方法，其中在加入沉溶剂之前，将含酶溶液浓缩大约1-10倍之间。
15.按权利要求
14所述的方法，其中水相产物的活性是≥350，000MWU/ml。
16.按权利要求
10所述的方法，其中淀粉是一种α-淀粉酶的底物。
17.按权利要求
16所述的方法，其中淀粉底物是玉米糖浆或麦芽糖糊精。
18.按权利要求
17所述的方法，其中淀粉底物是具有低于大约35的右旋糖当量的麦芽糖糊精。
19.按权利要求
2所述的方法来来制造一种实际上稳定的水溶液状的α-淀粉酶产物。
20.按权利要求
14所述的方法来制造一种实际上稳定的水溶液状的α-淀粉酶产物。
21.一种实际上水相稳定的溶液状的α-淀粉酶的配方，包括从地衣芽孢杆菌得到的耐热α-淀粉酶，以及大约0.1-50%W/V的淀粉。
22.按权利要求
21所述的配方，进一步包括除从地衣芽孢杆菌而得的耐热α-淀粉酶以外的淀粉酶，蛋白酶，或其混合物。
23.按权利要求
21所述的配方，进一步包含大约0%-80%从一组两性的，阴离子的，阳离子的，非离子的，两性离子的，或中极性非离子的表面活性剂，或它们的混合物而来的去污剂表面活性剂。
24.按权利要求
22所述的配方，进一步包括大约0%-80%的，从一组两性的，阴离子的，阳离子的，非离子的，两性离子的，或中极性非离子的表面活性剂，或它们的混合物而得到的去污剂表面活性剂。
专利摘要
本发明设想了一个从地衣芽孢杆菌得到稳定 的α-淀粉酶溶液的新的制备方法，而且用这方法 制造出高效能的液体酶产物。从发酵而得的含酶溶 液一般被浓缩并把淀粉加到这种浓缩液里。另一方 面，将象盐之类的沉淀剂加到溶液中并沉淀出含有 这种酶的滤饼。然后将这个滤饼与含有淀粉的水溶 液相接触而抽提出滤饼中的酶来提供一种稳定的液 体酶产物。
文档编号C12N9/96GK86107635SQ86107635
公开日1987年5月13日 申请日期1986年11月3日
发明者杰克·威廉·布鲁尔, 金忠烈, 柯蒂斯·杰里·蒙哥马利, 贾雅拉马·卡丹戈德·谢蒂 申请人:迈尔斯实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan