用培养基来重悬分离后的脐血单个核细胞，而非用生理盐水或者磷酸 盐缓冲液。前者更有优势：其一，可以比生理盐水提供更好的缓存体系，其二，可以比生理盐 水和磷酸盐缓冲液提供更好的细胞所需营养成分。
【附图说明】：
[0026] 图1为脐血MSC P1代细胞放大100倍的细胞形态图。
[0027] 图2为脐血MSC P1代流式检测结果显示。
【具体实施方式】：
[0028] 为更好地说明本发明，以下结合【具体实施方式】和附图作进一步说明。
[0029] 实施例1
[0030] 1....脐血单个核细胞的分离
[0031] 1. 1用10mL-次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的25ml脐血转移到50mL离心管 中。
[0032] 1. 2往上述脐血中加入等体积的RPMI1640培养基，用10mL -次性移液管混合均 匀。
[0033] 1. 3另取一支新的50mL离心管，用10mL -次性移液管每管加入12mL淋巴细胞分 离液（血液稀释液：淋巴分离液=2:1)，用10mL-次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至 淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
[0034] 1. 4700g离心30min，离心升降速率改为0。
[0035] 1. 5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液 层、脐血单个核细胞层、血浆层。用巴氏吸管将单个核细胞层吸出，转移至另一支50mL离心 管中。
[0036] 1. 6用10mL -次性移液管加RPMI1640培养基至40mL，重悬单个核细胞，400g离心 5min〇
[0037] 1. 7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40mL RPMI1640培养基充分重悬细 胞后，取20 y L细胞悬液于1. 5mL EP管中，用细胞计数仪进行计数，其余悬液250g离心 5min〇
[0038] 1. 9去上清，得到单个核细胞。
[0039] 2. ? ? ?脐血MSC的培养
[0040] 2.1将1.9中的单个核细胞用含10%马血清、10叩/111161^^?、1〇1^/111130卩的 MDM培养基（Gibco)重悬后，细胞密度为2X10 5/ml，接种至细胞培养瓶中。
[0041] 2. 2将上述细胞培养瓶转移至37度、5% 0)2的细胞培养箱中培养。
[0042] 2. 3培养至第6天，去除旧培养基，添加等量的新鲜頂DM培养基，含10 %马血清、 10ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF。
[0043] 2. 4此后，每三天换液一次，细胞培养基与2. 3 -样。
[0044] 2. 5当贴壁细胞汇合度达到85~90%时，进行常规细胞传代培养。
[0045] 3.…脐血MSC的鉴定
[0046] 3. 1取P1代的脐血MSC (见图1)，用流式细胞仪检测其表面抗原表达，结果显示， ⑶73、⑶90、⑶105呈阳性，⑶45为阴性，符合MSC表面抗原标志。
[0047] 图2为脐血MSC P1代流式检测结果，由图2显示⑶73、⑶90、⑶105呈阳性，⑶45 为阴性，符合MSC表面抗原标志。
[0048] 4....脐血MSC的培养方法比较
[0049] 4. 1取步骤1. 9所获得的脐血单个核细胞
[0050] 4. 2平均分成A、B、C、D四组，各组培养基组成如下表，均用T25细胞培养瓶进行常 规培养。
[0051]
【主权项】
1. 一种马脐血间充质干细胞的培养基，其特征在于，在頂DM培养基中添加马血清、 GM-CSF和SCF，其中马血清的体积百分数为1~50%;GM-CSF的质量浓度为1~100ng/ml ; SCF的质量浓度为1~100ng/ml，余量为MDM培养基。
2. 根据权利要求1所述的马脐血间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述马血清的 体积百分数为10% ;GM-CSF的质量浓度为10ng/ml ;SCF的质量浓度为10ng/ml，余量为 IMDM培养基。
3. 根据权利要求1所述的马脐血间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述IMDM培养 基为 Gibco,货号：31980030。
4. 权利要求1-3之一所述的马脐血间充质干细胞的培养基在细胞培养中的应用。
5. -种马脐血间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 单个核细胞的分离：将添加抗凝剂的脐血用生理盐水或细胞培养基稀释后，采用 密度梯度离心法得到单个核细胞； (2) MSC的培养：将单个核细胞用权利要求1所述的马脐血间充质干细胞的培养基进行 培养。
6. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述抗凝剂为枸橼酸钠。
7. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养基为RPMI1640培 养基；所述稀释比例为1:1~1:5。
8. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述密度梯度离心法是采用 Ficoll淋巴细胞分离液，100g~1000 g离心10~50min，吸取单个核细胞层，再用RPMI1640 培养基重悬细胞，100g~1000 g离心1~20min。
9. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述将单个核细胞用权利要求 1所述的细胞培养基进行培养是将单个核细胞用权利要求1所述的培养基重悬后，以1~ IOXlOVml的细胞密度接种于权利要求1所述的培养基中，在37°C、5% CO2条件下培养。
10. 根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述培养到达第6天时，去除旧 培养基，添加权利要求1所述的培养基，此后，每三天更换培养基一次。
【专利摘要】本发明公开了一种马脐血间充质干细胞的培养基及其分离培养方法，所述培养基是在IMDM培养基中添加马血清、GM-CSF和SCF，其中马血清的体积百分数为1～50％；GM-CSF的质量浓度为1～100ng/ml；SCF的质量浓度为1～100ng/ml，余量为IMDM培养基。利用本发明方法可以从马脐血中分离出MSC，并且培养脐血MSC时，添加GM-CSF和SCF，可有效提高脐血MSC的扩增效率。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104651304
【申请号】CN201510073554
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王一飞, 戴国胜, 王小燕
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月11日