6 °C lmin,72°C lmin) ,72°C 1min。
[0030](2)回收扩增获得的平末端PCR产物，并将其与pENTR/D-TOPO载体进行TOPO定向克隆，获得 pENTR/D-HaAK。
[0031](3)转化大肠杆菌菌株E.coli TOP 10感受态细胞，筛选抗Kan菌落，同时进行菌液PCR鉴定和测序分析。
[0032](4)以克隆的入门载体pENTR/D-HaAK为基础，进行LR反应，LB反应体系如下:Τ0Ρ0入门载体I yL，pANDA35HK载体质粒3yL，LR反应酶0.5yL。瞬时离心，25°C过夜，加0.5 yL Proteinase K，37°C 1min终止反应。构建出针对于HaAK靶标基因功能区域片段的RNAi载体pANDA35HK-dsHaAK (图1)，并将其转化至农杆菌LBA4404中。
[0033](5)取含pANDA35HK-dsHaAK质粒的农杆菌LBA4404单菌落于20mL LB液体培养基中，28°C、220r/min震荡培养2d，离心，用40mL MS液体培养基中悬浮，加入终浓度为100 μ M的乙酰丁香酮(AS)，继续培养2?3h，用浸花法转化拟南芥。
[0034]实施例3，农杆菌介导转化拟南芥
[0035](I)农杆菌感受态细胞的制备
[0036]取-80°C保存的LBA4404农杆菌划线接菌于含50 μ g/mL利福平(Rif)的YEB固体培养基，28°C培养48h，挑取农杆菌LBA 4404单克隆，接种于5ml YEB (50 μ g/mL Rif)液体培养基中，28°C、200rpm培养48h，以1: 100的接种量接种过夜培养菌液至含50 μ g/mL Rif的YEB液体培养基(三角瓶)中，28°C，200rpm继续培养至OD6J直到0.5左右，约6-10h。将菌液转至50mL灭菌离心管中，冰浴30min，4°C，5000rpm离心菌液5min，弃上清。向离心管中加入1mL预冷的0.1M(灭菌后的)NaCl，彻底悬浮农杆菌细胞沉淀(整个操作过程动作要轻柔)；4°C，5000rpm离心5min，弃上清，重复上述步骤一次。弃上清，每个50离心管用0.5mL预冷的20mM(灭菌后的)CaCl2重悬细胞沉淀(操作过程在超净台内完成，操作要轻柔)。将菌液分装至冰上预冷的1.5mL离心管，每管分装100 μ L菌液，直接进行下一步转化；或加入等体积的30%灭菌后甘油混匀(使甘油终浓度为15% )，液氮速冻，-800C保存。
[0037](2) RNAi载体转化农杆菌
[0038]在LBA4404感受态细胞加入2 μ L构建好的pANDA35HK_dsHaAK质粒，混匀，利用电激仪电激转化后，在菌液加入500 μ L新鲜YEB液体培养基，28°C培养2_4h后，涂布于含50 μ g/mLRif和50 μ g/mLKan的固体YEB平板上，挑取培养基平板上长出的菌落进行菌落PCR鉴定。
[0039](3)农杆菌介导法转化拟南芥
[0040]含有目的基因的农杆菌采用浸花法转化野生型拟南芥，用50mg/L Kan对Tl代转化植株的种子进行抗性筛选，将获得的抗性植株种植在盆钵中，于恒温22°C、16h/8h光照周期的人工气候室中培养。
[0041]实施例3，转基因拟南芥PCR的检测
[0042](I)采用天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，提取抗性植株的基因组DNA。以特异性引物对:5 ' -CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT-3 '和5' -TTACAGCGACTTCTCAATT-3'，进行 PCR反应。扩增体系为:10 XEx PCR Buffer 2.5 μ L，
2.5mmol/L dNTP Mixture2 μ L，10 μ mol/L 引物 F2 与 Rl 各 I μ L，拟南芥基因组 DNA 2 μ L，Ex Taq (5U/ μ L) 0.25 μ L，加双蒸水至 25 μ L。扩增条件为 94°C 5min，35 个循环(94°C lmin,56 °C lmin，72°C lmin), 72 °C 1min0检测获得转基因拟南芥植株(图2)。
[0043](2)采用天根生化公司的Plant RNA Kit提取植株叶片总RNA。制备含7mmol/L尿素的12%的变性聚丙烯酰胺凝胶，RNA上样量为10 μ g，300V电泳至溴酚蓝迀移至胶的底部，在半干电转仪中进行转膜，转膜之后去除胶，将膜至于紫外光下照射进行核酸固定。采用 DIG High Prime DNA Labeling and Detect1n Starter Kit 制备 DNA 探针(制备探针的特异引物为 5 ' -CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT-3 '和 5 ' -TTACAGCGACTTCTCAATT-3 ')并进行预杂交和杂交。预杂交时膜在50°C条件下孵育2h，换上含有变性过的探针的杂交液后在 5CTC杂交过夜。按照 DIGHigh Prime DNA Labeling and Detect1n Starter Kit II试剂盒上的说明对膜进行免疫荧光显色反应，检测HaAK dsRNA的表达(图3)。
[0044]实施例4，转基因拟南芥防治棉铃虫的效果
[0045](I)饲喂转基因拟南芥对棉铃虫1-2龄幼虫影响
[0046]选取孵化I天左右I龄棉铃虫幼虫，分成四组每组20头，以正常的拟南芥为对照，以筛选的转基因拟南芥AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂。利用体视显微镜(Olympus SZX7，Japan)拍照记录拟南芥叶片被取食情况，结果表明，饲喂三天后转基因拟南芥AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l对棉铃虫的致死率分别为32%、38%和55%，明显的高于对照18% (图4)。
[0047](2)饲喂转基因拟南芥对3龄棉铃虫幼虫影响
[0048]选取三龄棉铃虫幼虫若干，分成四组每组20头，以正常的拟南芥为对照，以筛选的转基因拟南芥AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂，记录取食后棉铃虫体重的变化，结果显示，三个实验组植株AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8和AtdsHaAK-1l危害相对较轻，转基因拟南芥对棉铃虫有明显的抑制作用，对照组体重的增加量明显高于实验组(图5)。
[0049](3)饲喂转基因拟南芥对棉铃虫HaAK基因mRNA表达水平的影响
[0050]给3龄棉铃虫取持续饲喂AtdsHaAK-8、AtdsHaAK-1I转基因拟南芥，在I到5天内每天随机挑选各组I头取食转基因拟南芥的棉铃虫，提取总的RNA, qRT-PCR结果表明，取食两种转基因拟南芥棉铃虫体内HaAK基因的转录水平被持续抑制，AtdsHaAK-8转基因拟南芥对棉铃虫HaAK的表达抑制效果更好。
[0051](4)饲喂转基因拟南芥对棉铃虫HaAK基因酶活性的影响
[0052]取持续饲喂AtdsHaAK-8转基因拟南芥I到5天的棉铃虫，参照Mao et al.(2007)方法，将匀浆液在4°C，12 OOOrpm条件下，离心30min去获得粗酶液。使用分光光度计，在pH 8.6、30°C条件下去测定精氨酸激酶的活性。酶活单位定义为:在pH 8.6、30°C条件下每分钟将 1.0 μ mole L-arginine 和 ATP 转变为 N-phospho-L-arginine 和 ADP 定义为 I 个酶活单位。与未处理的对照组相比，持续饲喂5天后，实验组AK酶的活性只保留了约60%的活性；而未处理的对照组AK酶活几乎没有变化，依然保持原有水平。
【主权项】
1.选用昆虫能量代谢的关键酶基因一一精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫，其特征在于:选择棉铃虫HaAK基因作为RNAi的靶标基因。
2.—种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体，其特征在于:HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，其中两个HaAK基因片段之间包含一个guslinker fragment，所述的HaAK是棉铃虫的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均为从棉铃虫中克隆获得的HaAK的全长cDNA序列。
3.根据权利要求2所述的重组植物表达载体，其中所述载体是一种质粒。所述的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。
4.根据权利要求2所述的RNAi载体，转化拟南芥，获得棉铃虫取食后能抑制其生长发育的转基因植株。
【专利摘要】本发明涉及一种在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用，属于农业生物技术领域。本发明提供了选用棉铃虫能量代谢关键酶基因——精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫方法。本发明具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体及其在沉默目的基因中的应用。所述载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK基因的dsRNA的转基因植物。通过将转基因植株与野生型植株对比显示：取食这种转基因植物可影响棉铃虫的生长发育。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-74, C12N15-70, C12N15-82
【公开号】CN104694566
【申请号】CN201410669211
【发明人】刘峰, 赵伊英, 汪小东, 孙杰
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年11月12日