[0044] 实施例2
[0045] 1?制备HBSS消毒液和细胞培养液
[0046] HBSS消毒液：向Hanks平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的浓度为 200yg/ml，硫酸链霉素浓度为200yg/ml。
[0047] 基础培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的10%。
[0048] 原代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积 的20%，硫酸卡那霉素的浓度为180yg/ml，硫酸链霉素浓度为100yg/ml。
[0049] 传代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积 的20%，硫酸卡那霉素的浓度为100yg/ml，硫酸链霉素浓度为50yg/ml。
[0050] 调节上述培养液的pH值为7. 2,放置于4°C冰箱中保存备用。
[0051] 2?原代培养
[0052] 先用15mg/L亚甲基蓝浸泡鲜活暗色唇鱼15分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒 后，用纱布擦除体表粘液；再次以75%酒精消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器 械取其肝脏，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织。浸泡15分钟后，将肝脏组织 用HBSS消毒液清洗5次，剪成约100mm3的组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在 28°C培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3ml，在28°C培养箱中启动原代培养，每三 天半量更换培养液，第6天细胞开始从组织块中迀移，18天长成细胞单层。
[0053] 3?传代培养
[0054] 原代肝脏细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 1 %的EDTA溶液lml，消化2分钟，细胞变圆 后，加入传代培养液1. 8ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按 1:1传，此后按1:2进行传代，于28°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第6代时， 细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至50代。
[0055] 4.细胞冻存与复苏
[0056] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMS0,按13:1的体积比混合， 现用现配。
[0057] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心7 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1X106 个/ml，将lml细胞悬液转移至1. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°c过夜， 然后放入液氮中长期保存。
[0058] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养 液，lOOOrpm离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，28°C 培养箱中培养，6天细胞即长成单层。
[0059] 实施例3
[0060] 1.制备HBSS消毒液和细胞培养液
[0061] HBSS消毒液：向Hanks平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的浓度为 300yg/ml，硫酸链霉素浓度为300yg/ml。
[0062] 基础培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的15%。
[0063] 原代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积 的20%，硫酸卡那霉素的浓度为200yg/ml，硫酸链霉素浓度为150yg/ml。
[0064] 传代培养液：向高糖DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积 的20%，硫酸卡那霉素的浓度为200yg/ml，硫酸链霉素浓度为150yg/ml。
[0065] 调节上述培养液的pH值为7. 4,放置于4°C冰箱中保存备用。
[0066] 2?原代培养
[0067] 先用20mg/L亚甲基蓝浸泡鲜活暗色唇鱼10分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒 后，用纱布擦除体表粘液；再次以75%酒精消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器 械取其肝脏，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝脏组织。浸泡15分钟后，将肝脏组织 用HBSS消毒液清洗5次，剪成约100mm3的组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在 30°C培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液4ml，在30°C培养箱中启动原代培养，每三 天半量更换培养液，第5天细胞开始从组织块中迀移，15天长成细胞单层。
[0068] 3?传代培养
[0069] 原代肝脏细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 1 %的EDTA溶液2ml，消化2分钟，细胞变圆 后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1 传，此后按1:2进行传代，于30°C培养箱中继续培养；每4天传代一次，传至第6代时，细胞 培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至50代。
[0070] 4.细胞冻存与复苏
[0071] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMS0,按13:1的体积比混合， 现用现配。
[0072] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心7 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1X106 个/ml，将lml细胞悬液转移至1. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C过夜， 然后放入液氮中长期保存。
[0073] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养 液，lOOOrpm离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，30°C培养箱中培养，5天细胞即长成单层。
[0074] 实施例4
[0075] 对实施例2的暗色唇鱼的鱼体采用不同消毒方法进行比较。
[0076] 将实施例2中的暗色唇鱼分别采用最常见的高锰酸钾浸泡消毒、亚甲基蓝浸泡消 毒和直接酒精消毒，其他步骤与实施例2中的步骤相同。结果表明（参见表1)，高锰酸钾对 其毒性太强，组织块不易迀出细胞，且迀出细胞不易贴壁，而单独的亚甲基蓝或者酒精浸泡 消毒，细胞的迀出效果不甚理想，易发生污染。当亚甲基蓝浸泡和酒精消毒联合作用时，结 果显示这样处理后的鱼体所得到的肝脏细胞系污染率下降，
[0077] 对细胞的迀出也影响不大。
[0078] 表1.采用不同消毒方式的情况下组织块细胞迀出情况
【主权项】
1. 一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤： 1) 暗色唇鱼肝脏的获取：先用10-20mg/L亚甲基蓝浸泡暗色唇鱼10-30分钟，对鱼进 行整体消毒；整体消毒后，用纱布擦除鱼体表粘液；再以75%酒精消毒鱼体后，加入HBSS消 毒液浸泡肝脏组织；浸泡15-20分钟后，将肝脏组织用HBSS消毒液清洗； 2) 原代培养：将所述肝脏组织剪成约IOOmm3的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶 中，在24-30°C培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在24-30°C培养箱中启动原代 培养，每三天半量更换所述原代培养液，第5-7天细胞开始从组织块中迀移，15天长成细胞 单层； 3) 传代培养：原代肝脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养 液，以含0. 2%的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，首次传代按1:1传，此后按1:2进行 传代，于24-30°C培养箱中继续培养；每4-5天传代一次，传至第6代时，细胞培养液换成基 础培养液，所述暗色唇鱼肝脏细胞系建立成功。
2. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300yg/ml 的硫酸卡那霉素和浓度为100-300yg/ml的硫酸链霉素的Hanks平衡盐溶液。
3. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述基础培养液为含有占总体积的10-15%的 胎牛血清的高糖DMEM培养液。
4. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述原代培养液为含有占总体积的20%的胎牛 血清、浓度为150-200yg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为50-150yg/ml的硫酸链霉素的高 糖DMEM培养液。
5. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述传代培养液为含有占总体积的20%的胎牛 血清、浓度为50-150yg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为30-60yg/ml的硫酸链霉素的高糖 DMHM培养液。
6. 如权利要求1-5所述的构建方法，其中溶液的pH值为7. 0-7. 4。
7. 如权利要求1-5所述的构建方法，该构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤： 1) 配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按13:1的体积比混合，现用现 配； 2) 细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000-1200rpm离 心7-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为 IXIO6个/ml，将Iml细胞悬液转移至I. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C 过夜，然后放入液氮中长期保存； 3) 细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化；然后 在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量高糖DMEM基础培养液， 800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用所述基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶 中，24-30 °C培养箱中培养，5-7天细胞即长成单层。
【专利摘要】本发明涉及一种暗色唇鱼肝脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)暗色唇鱼肝脏的获取：亚甲基蓝和酒精联合对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有硫酸卡那霉素和硫酸链霉素的高糖DMEM培养液进行培养；3)传代培养：传至第6代时，细胞培养液换成基础培养液，所述暗色唇鱼肝脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的暗色唇鱼肝脏细胞系形态为不规则多角形，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对暗色唇鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。
【IPC分类】C12R1-91, C12N5-071
【公开号】CN104818239
【申请号】CN201510204441
【发明人】潘晓赋, 王晓爱, 杨君兴, 刘倩
【申请人】中国科学院昆明动物研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月27日