一种洋葱活性多肽提取物的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取物的制备技术领域，具体涉及一种洋葱活性多肽提取物的制 备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 活性肽的制备方法主要有：天然活性肽的分离提取、食品蛋白质水解（包括酸水 解、碱水解、酶水解）、化学合成法、基因重组法等。研宄表明，在营养蛋白的多肽链内部可 能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些蛋白，可将活性多肽释放出来。与酸水解 和碱水解相比，酶法水解蛋白具有条件温和、反应时间短、不产生消旋作用、不破坏氨基酸、 产物纯度高、易分离、无污染等特点。而化学合成法和基因工程生产活性肽需要相当大的投 入，其安全性也要进行研宄。因此，酶法水解蛋白是目前制备生物活性肽的主要方法。
[0003] 洋葱（AlliumcepaL.)别名葱头、圆葱等，百合科、葱属二年生草本植物，被誉为 "菜中皇后"，食用和药用价值较高。目前临床常用糖尿病药物长期服用会产生耐药性、抗药 性、肝肾损伤等副作用，同时伴有体重增加、低血糖等不良反应，而生物多肽类药物具有活 性好、疗效高、分子量小、副作用少等独特的优势，为糖尿病的预防和治疗开辟了新的思路。 结合现代化学与药理研宄成果，对洋葱多肽类成分加以开发利用，发掘新药，将拓宽洋葱物 质资源的应用范围。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供了一种洋葱活性多肽提 取物的制备方法，该方法采用酸溶碱沉获得洋葱蛋白，然后通过复合酶酶解、凝胶层析、冷 冻干燥等步骤从洋葱中获得活性多肽提取物。
[0005] 本发明的另一个目的是提供了一种上述方法制备的洋葱活性多肽提取物在制备 预防或治疗糖尿病、高血脂的药物、保健食品及食品中的应用。
[0006] 本发明的第一个目的通过如下技术方案来实现：
[0007] -种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
[0008] (1)取洋葱，切丁、勾衆，加入洋葱重量1-3倍的0. 2mol/LpH5. 0-7. 0的磷酸盐缓 冲液浸泡，置于4°C冰箱12小时后，冷冻离心，上层即为洋葱蛋白粗提液；
[0009] 优选的，所述洋葱为紫皮洋葱；
[0010] 优选的，所述磷酸盐缓冲液pH为6. 0,磷酸盐缓冲液用量为洋葱重量的2倍；
[0011] 优选的，步骤⑴中所述冷冻离心条件为4°C、10000转/分钟下离心20分钟；
[0012] (2)向步骤⑴所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其1/3-1倍体积的95v/v%乙醇， 然后用0. 6w/w%NaOH溶液调节pH至8. 0,冰浴中静置过夜后，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干 燥即得洋葱蛋白冻干粉；
[0013] 优选的，所述95v/v%乙醇用量为洋葱蛋白粗提液体积的0. 5倍；
[0014] 优选的，步骤（2)中所述冷冻离心条件为4°C、10000转/分钟下离心20分钟；
[0015] (3)向步骤（2)所得洋葱蛋白冻干粉中加入6-8倍重量的蒸馏水稀释，然后用 0?lmol/LHC1 调节pH至 3. 5 ;
[0016] 优选的，所述蒸馏水用量为洋葱蛋白冻干粉重量的7倍；
[0017] (4)向步骤（3)所得溶液中按酶底比1: (8-12)加入酸性蛋白酶，在55°C下酶解 1-3小时，灭酶，冷却；
[0018] 步骤（4)中所述酶底比为酸性蛋白酶与步骤（2)所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；
[0019] 所述酸性蛋白酶的活力为50000u/g ;
[0020] 优选的，所述酶底比为1:10 ;
[0021] 优选的，所述酶解时间为2小时；
[0022] 优选的，所述灭酶条件为95°C、15分钟；
[0023] 所述冷却为冷却至室温；
[0024] (5)用0?lmol/LHC1调节步骤⑷所得溶液pH至1. 5,按酶底比1: (50-70)加入 胃蛋白酶，在37°C下酶解1-3小时，灭酶，冷却，4°C、20000转/分钟离心30分钟，收集上清 液；
[0025] 步骤（5)中所述酶底比为胃蛋白酶与步骤⑵所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；
[0026] 所述胃蛋白酶的活力为3000u/mg ;
[0027] 优选的，所述酶底比为1:60 ;
[0028] 优选的，所述酶解时间为2小时；
[0029] 优选的，所述灭酶条件为95°C、15分钟；
[0030] 所述冷却为冷却至室温；
[0031] (6)将步骤（5)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7mg/mL的溶液（命名为 "稀释液")，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000-1000D的组分，冷冻干燥，即得到洋葱 活性多肽提取物冻干粉。
[0032] 优选的，将步骤（5)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5mg/mL的溶液，葡聚 糖凝胶层析的分离条件为：凝胶色谱柱（SuperdexPeptide10/300GL)，流动相为0.2mol/ L的磷酸盐缓冲液（pH7. 4)，流速0. 5mL/min;
[0033] 经峰面积计算，收集的分子量3000-1000D的组分占前述稀释液总质量的 70. 8-89. 2%，得到的洋葱活性多肽提取物冻干粉中总多肽含量为36. 8-50. 7w/w%。
[0034] 根据上述制备方法得到的洋葱活性多肽提取物，可用于制备预防或治疗糖尿病、 尚血脂的药物、保健食品及食品。
[0035] 与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
[0036] 本发明突破了洋葱药效物质基础的研宄思路，直接指向多肽类成分，提高了洋葱 资源的利用率，开辟了其新的药用、食用途径。
[0037] 本发明所得的洋葱活性多肽提取物具有明显的口服预防和治疗糖尿病、高血脂的 作用。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例进一步阐述本发明的洋葱活性多肽提取物的制备方法及其 应用。
[0039] 以下实施例中所用洋葱均为市售紫皮洋葱。
[0040] 以下实施例中所用0. 2mol/L磷酸盐缓冲液配置方法如下：
[0041] 称取6. 72g十二水合磷酸二氢钠溶于100mL蒸馏水中，得0. 2mol/L磷酸二氢钠溶 液，再用0. 6mol/L氢氧化钠调节pH值至5. 0,即得pH5. 0的磷酸盐缓冲液。
[0042] 称取十二水合磷酸二氢钠0. 881g及二水合磷酸氢二钠0. 242g溶于100mL蒸馏水 中，即得pH6. 0的磷酸盐缓冲液；用0. 6mol/L氢氧化钠调节pH至7. 0,即得pH7. 0的磷酸 盐缓冲液；用〇. 6mol/L氢氧化钠调节pH至7. 4,即得pH7. 4的磷酸盐缓冲液（流动相）。
[0043] 以下实施例中所用酸性蛋白酶的活力均为50000u/g(250g/瓶，上海金穗生物科 技有限公司）。
[0044]以下实施例中所用胃蛋白酶的活力均为3000u/mg，5g/瓶，进口分装。
[0045] 以下实施例中所用葡聚糖凝胶层析柱均为：Superdex Peptide 10/300GL(GE公 司
[0046] 实施例1 :
[0047] 一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
[0048] (1)取紫皮洋葱，切丁、勾衆，加入洋葱重量2倍的0. 2mol/LpH5. 0的磷酸盐缓冲 液浸泡，置于4°C冰箱12小时后，4°C下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白 粗提液；
[0049] (2)向步骤⑴所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入与其等体积的95v/v%乙醇，然 后用0. 6w/w%NaOH溶液调节pH至8. 0,冰浴中静置过夜后，4°C下，10000转/分钟下离心 20分钟，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；
[0050] (3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其6倍重量的蒸馏水稀释，然后用0. lmol/LHCl调节 pH至 3. 5 ;
[0051] (4)向步骤（3)所得溶液中按酶底比1:8加入酸性蛋白酶，于55°C酶解2小时后， 95°C、15分钟灭酶，冷却至室温；
[0052] (5)用0?lmol/LHC1调节步骤⑷所得溶液pH至1. 5,按酶底比1:50加入胃蛋 白酶，于37°C酶解1小时后，95°C、15分钟灭酶，冷却至室温，4°C下、20000转/分钟离心30 分钟，收集上清液；
[0053] (6)将步骤（5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖凝 胶层析（3即61(^?6卩1:1(16 10/30(^柱，流动相为0.21]1〇1/1磷酸盐缓冲液（卩117.4)，流速 0. 5mL/min，进样量0. 5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面 积计算，所收集的组分占总面积的72. 3 %，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥， 即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为42.lw/w%。
[0054] 实施例2 :
[0055] -种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
[0056] (1)取紫皮洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量2倍的0. 2mol/L pH 6. 0的磷酸盐缓冲 液浸泡，置于4°C冰箱12小时后，4°C下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白 粗提液；
[0057] (2)向步骤⑴所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其体积0. 5倍的95v/v%乙醇，然 后用0. 6w/w%NaOH溶液调节pH至8. 0,冰浴中静置过夜后，4°C下，10000转/分钟下离心 20分钟，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；
[0058] (3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其8倍重量的蒸馏水稀释，然后用0. lmol/LHCl调节 pH至 3. 5;
[0059] (4)向步骤（3)所得溶液中按酶底比1:10加入酸性蛋白酶，于55°C酶解2小时 后，95°C、15分钟灭酶，冷却至室温；
[0060] (5)用0?lmol/LHC1调节步骤⑷所得溶液pH至L5,按酶底比1:70加入胃蛋 白酶，于37°C酶解1小时后，95°C、15分钟灭酶，冷却至室温，4°C下、20000转/分钟离心30 分钟，收集上清液；
[0061] (6)将步骤（5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝 胶层析（3即61(^?6卩1:1(16 10/30(^柱，流动相为0.21]1〇1/1磷酸盐缓冲液（卩117.4)，流速 0. 5mL/min，进样量0. 5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面 积计算，所收集的组分占总面积的80. 1 %，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥， 即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为36. 8w/w%。
[0062] 实施例3 :
[0063] -种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
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