Mg-132在cho工程细胞表达外源蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及MG-132在CH0工程细胞表达外源蛋白中的应 用。
【背景技术】
[0002] 蛋白药物（单克隆抗体Abs和Fc融合蛋白）在市场上达到60多亿美元的销售额， 而CH0细胞是良好的外源蛋白表达宿主，在上市药物中多由其表达。细胞培养的过程中，死 亡的细胞裂解后会分泌蛋白酶降解分泌到上清的药物蛋白，从而降低重组蛋白的表达量； 同时也有学者通过筛选，发现高活率的细胞会分泌蛋白酶Cathepsin-D来降解蛋白，从而 影响重组蛋白的质量。
[0003] MG-132是一种蛋白酶体抑制剂，可抑制哺乳动物细胞内泛素化蛋白质的降解。目 前，尚未有将MG-132应用于CH0细胞表达外源蛋白过程中的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供MG-132在CH0工程细胞表达 外源蛋白中的应用。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：MG-132在CH0工程细胞表达外源蛋白中的 应用，不仅能提高外源蛋白的产量，也能提高外源蛋白的质量。
[0006] 所述的MG-132在CH0工程细胞表达外源蛋白中的应用，包括如下步骤：在CH0工 程细胞进入稳定生长期时加入MG-132。
[0007] 所述的MG-132的使用浓度范围40~50ymol/L。
[0008] 所述的CH0工程细胞培养时所使用的培养基优选为含3. 5~4. 5mmol/L谷氨酰 胺，0. 08~0. 12mmol/L次黄嘌呤和0. 015~0. 020mmol/L胸腺嘧啶的CH0细胞培养基。
[0009] 所述的CH0工程细胞指的是含有外源蛋白表达基因的CH0细胞；优选为转编码人 肿瘤坏死因子受体Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的基因的CH0细胞。
[0010] 所述的转TNFR-Fc基因的CH0细胞的制备过程可参考专利号为201210380254. 1、 名称为"编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用"的国家发明专利进行制备。
[0011] 所述的CH0细胞为常规的表达外源基因的中国仓鼠卵巢细胞。
[0012] 所述的人肿瘤坏死因子受体Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的氨基酸序列如下：
[0013] MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTK TSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPG FGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTR SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTCDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPQVKFNWYVDGVQVHNAKTKPREQQYNSTYRVVSVLTVLHQNWLDGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKo
[0014] 编码所述的人肿瘤坏死因子受体Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的核苷酸序列如下：
[0015] ATGGCCCCCGTGGCCGTGTGGGCTGCCCTGGCCGTGGGACTGGAACTGTGGGCTGCTGCCCACGCCCTG CCCGCCCAGGTGGCCTTCACCCCCTACGCCCCCGAGCCAGGCAGCACCTGCAGGCTGAGAGAGTACTACGACCAGAC CGCCCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCTCCAGGCCAGCATGCCAAGGTGTTCTGCACCAAGACCAGCGACACCGTGT GCGACAGCTGCGAGGACAGCACCTACACCCAGCTGTGGAACTGGGTGCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCAGCAGGTGC TCTAGCGACCAGGTCGAGACCCAGGCCTGCACCAGAGAGCAGAACAGGATCTGCACCTGCAGACCCGGCTGGTACTG CGCCCTGAGCAAGCAGGAAGGCTGCAGGCTCTGCGCCCCACTGAGGAAGTGCAGGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAGAC CCGGCACCGAGACCTCCGACGTGGTGTGCAAGCCCTGCGCCCCAGGCACCTTCAGCAACACCACCTCCAGCACCGAC ATCTGCAGGCCCCACCAGATCTGCAACGTGGTGGCTATCCCCGGCAATGCCAGCATGGACGCCGTGTGCACCAGCAC CTCCCCCACCAGAAGCATGGCCCCAGGCGCCGTGCACCTGCCCCAGCCCGTGAGCACCAGGTCCCAGCACACCCAGC CCACCCCAGAGCCTAGCACCGCCCCCTCTACCAGCTTCCTGCTGCCCATGGGCCCCAGCCCTCCAGCCGAGGGCAGC ACCGGCGACGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACC CAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAGGACCCACAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGCAGGTGCACAACGCCAAGACC AAGCCCCGGGAGCAGCAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGAACTGGCTGGA CGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGG GCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCTCTCGAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAA GACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGC AGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG TCCCCCGGCAAGTGATGA。
[0016] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0017] 本发明提供了蛋白酶体抑制剂MG-132的一种新功能，是在CH0细胞表达外源蛋白 时进行应用，以提高外源蛋白的表达量。本发明验证了在含有表达TNFR-Fc融合蛋白外源 基因的CH0细胞生长后期（细胞密度1.OX107~1. 5X10 7cells/mL)添加蛋白酶体抑制剂 MG-132,蛋白的表达量提高20%~50%，并且具有活性的二聚体比例提高20%~30% (w/ w)，通过中和TNFa介导的细胞毒性实验，证明TNFR-Fc融合蛋白对人TNFa中和活性，即 亲和力（比活性）与未添加MG-132组差异无显著意义。
【附图说明】
[0018] 图1是添加不同浓度MG-132后TNFR-Fc融合蛋白表达量的检测结果图。
[0019] 图2是纯化后的目的蛋白TNFR-Fc的高效液相色谱HPLC图谱图。
[0020] 图3是TNFR-Fc融合蛋白阻断TNFa诱导的L929细胞毒作用的结果图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0022] 实施例1
[0023] (1)CH0工程细胞的培养：将稳定表达TNFR-Fc融合蛋白的CH0细胞（按专利号为 201210380254. 1、名称为"编码重组人TNFR-Fc融合蛋白的基因及其应用"实施例构建得到 的重组TNFR-Fc-2 基因的CHO细胞株）接种到HyClone?HyCell?CHOMedia，包含 4mmol/ L谷氨酰胺，0. 10mmol/L次黄嘌呤和0. 020mmol/L胸腺嘧啶，接种密度为0. 5X106个细胞 /mL，接种体积为10mL于一次性透气生物反应器50mLTubespin管中，培养温度为37°C，转 速为180rpm，C02浓度为6%，培养至稳定期，细胞密度达到1. 2X10 7cells/mL。
[0024] MG-132 粉末（Selleck)于-80°C保存，溶于DMS0 配制 40mmol/L保存浓度，-80°C 保存，1个月内使用。按设定浓度梯度添加到细胞培养液中，继续培养3天直到细胞活率低 于70 % ;同时设定空白对照，为DMS0,DMS0在培养基中的终浓度为质量百分比1 %。通过 ELISA法检测相对表达量，结果如图1所示，不添加MG-132时，表达量设定为1 ;MG-132的 浓度为40ymol/L~50ymol/L时，表达量高于1，且高于DMS0组，可见MG-132能导致外源 蛋白分泌量的增加。
[0025] (2打即1?4(3融合蛋白的纯化：将步骤（1)得到的培养液于6000印111离心10111111，取 上清经〇.45um滤膜过滤，经过rProteinABestarose4FastFlow(博格隆，5mL)进行亲 和层析，亲和层析平衡缓冲液为20mmol/L、pH7. 2的PB缓冲液；亲和洗杂缓冲液为20mmol/ L、pH7. 2的PB缓冲液+150mmol/LNaCl;洗脱缓冲液为100mmol/L、pH3. 2甘氨酸缓冲液； 流速为1. 5mL/min。收集洗脱峰，进行10%SDS-PAGE，以Enbrel?作为阳性对照标准品。
[0026] 同时使用TSKgelG3000SWXL(7.8mmX300mm)凝胶色谱柱，流速为 0.5mL/min， 流动相为pH7.0、500mmol/LPB+1% (v/v)异丙醇测定二聚体含量。利用操作软件 Chromeleon的ExrernalOverlay功能把不同浓度的MG-132处理后纯化的TNFR-Fc的出峰 时间，调整时间轴和UV280轴整合到一起，结果如图2和表1所示，添加了MG-132,目的蛋白 TNFR-Fc的二聚体含量增高，二聚体为目的产物。
[0027] 表1TNFR-Fc的二聚体含量统计
【主权项】
1. MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用，其特征在于：所述的CHO工程细胞 是含有外源蛋白表达基因的CHO细胞。
2. 根据权利要求2所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用，其特征在于 包括如下步骤：在CHO工程细胞进入稳定生长期时加入MG-132。
3. 根据权利要求2所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用：所述的CHO 工程细胞为转编码TNFR-Fc融合蛋白的基因的CHO细胞。
4. 根据权利要求3所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用：所述的 TNFR-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
5. 根据权利要求4所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用：编码所述 的TNFR-Fc融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
6. 根据权利要求1所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用，其特征在 于：所述的MG-132的使用浓度范围40ymol/L~50ymol/L〇
7. 根据权利要求1所述的MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用，其特征在 于：所述的CHO工程细胞培养时所使用的培养基为含3. 5~4. 5mmol/L谷氨酰胺，0. 08~ 0. 12mmol/L次黄嘌呤和0. 015~0. 020mmol/L胸腺嘧啶的CHO细胞培养基。
【专利摘要】本发明公开了MG-132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用。在含有外源蛋白表达基因的CHO细胞，即CHO工程细胞表达外源蛋白时加入MG-132，能提高外源蛋白的表达量。本发明提供了MG-132的一种新用途，也提供了一种提高CHO工程细胞外源蛋白表达量的方法。
【IPC分类】C12P21-00, C12P21-02
【公开号】CN104818309
【申请号】CN201510208876
【发明人】熊盛, 温家明, 谢秋玲, 钱垂文, 邹纯彬
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月28日