冠状病毒通用核酸检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了一群重要病毒(即冠状病毒)的通用检测方法，用于甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒的检测，在生物学研宄、医学诊断和兽医诊断上有较大的使用价值。
[0002]
【背景技术】
[0003]冠状病毒是人、禽、犬、猪等动物重要的病原，可以分为甲冠状病毒属Firw1S)、乙冠状病毒雇t iBetacoronavirusy、丙冠状病毒属(Firw1S)、丁冠状病毒属iDeItacoronavirus)四个属，每个属又有若干种冠状病毒。
[0004]检测病毒核酸是检测病毒重要方法之一。目前，国内外对冠状病毒的各种核酸检测方法都是仅针对一个属或一个种的冠状病毒，没有针对所有属的冠状病毒的通用核酸检测方法。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明针对上述现有冠状病毒检测技术的不足，开展了深入研宄和测试，建立了甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒通用核酸检测方法。该方法包括以下三个方面内容:
(一)确立了核酸检测所需要的引物序列，针对冠状病毒Ib等基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有25个碱基，序列为tgggttgggaytaycctaart gtga(即序列表中SEQ ID N0.1，其中y和r是简并碱基，y表示t和c的混合物，r表示g和a的混合物)，下游上游引物序列含有23个碱基，序列为tgytgtgarcaraaytcatgwgg (即序列表中SEQ IDN0.2，其中y、r和w是简并碱基，y表示t和c的混合物，r表示g和a的混合物，w表示a或t的混合物)；
(二)确立了检测反应种类，可以采用多种检测反应，包括普通的逆转录-聚合酶链式反应(通常，这类反应产物用核酸电泳进行检测)、荧光逆转录-聚合酶链式反应(通常，这类反应产物用荧光物质进行检测)或依赖核酸序列扩增反应(通常，这类反应产物用电化学发光物质进行检测)。
[0007](三)确立了检测反应体系和反应条件，以普通逆转录-聚合酶链式反应为例，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水7.5微升、2倍一步法逆转录-聚合酶链式反应缓冲液
12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸)、一步法逆转录-聚合酶链式反应所需要的逆转录酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(浓度为10微摩尔每升)、第一步所合成的下游引物I微升(浓度为10微摩尔每升)、需要检测的冠状病毒核酸2微升(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将逆转录-聚合酶链式反应体系密闭，置于聚合酶链式反应仪器(国内常称为PCR仪)上进行逆转录-聚合酶链式反应，反应条件为50摄氏度30分钟，然后94摄氏度2分钟，再进行40个循环，每个循环为94摄氏度30秒，55摄氏度30秒，72摄氏度30秒，循环结束后72摄氏度延伸5至10分钟；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为520至570个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0008]
【具体实施方式】
[0009]下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
[0010]本实施例用逆转录-聚合酶链式反应，对冠状病毒进行通用核酸检测，包括如下步骤:
第一步(合成引物):按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2)，人工合成逆转录-聚合酶链式反应所需要的上游引物和下游引物；
第二步(配置逆转录-聚合酶链式反应体系):在聚合酶链式反应管中依次加入纯水7.5微升、2倍一步法逆转录-聚合酶链式反应缓冲液12.5微升(含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸)、一步法逆转录-聚合酶链式反应所需要的逆转录酶和核酸聚合酶的混合物I微升、第一步所合成的上游引物I微升(浓度为10微摩尔每升)、第一步所合成的下游引物I微升(浓度为10微摩尔每升)、需要检测的冠状病毒核酸2微升(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的);
第三步(进行逆转录-聚合酶链式反应):将第二步配置好的逆转录-聚合酶链式反应体系密闭后，置于聚合酶链式反应仪器(国内常称为PCR仪)上进行逆转录-聚合酶链式反应，反应条件为50摄氏度30分钟，然后94摄氏度2分钟，再进行40个循环，每个循环为94摄氏度30秒，55摄氏度30秒，72摄氏度30秒，循环结束后72摄氏度延伸5至10分钟；第四步(逆转录-聚合酶链式反应结果检测):在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为520至570个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0011]实际应用结果:对I份人冠状病毒标准阳性临床样品、对2份猪冠状病毒标准阳性临床样品、401份鸡冠状病毒标准阳性临床样品、82份鸭冠状病毒标准阳性临床样品、I份鹅冠状病毒标准阳性临床样品、64份鸽冠状病毒标准阳性临床样品，以及4592份来自禽和人的标准阴性样品，用上述冠状病毒通用核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为99.64%，特异性为99.73%。
【主权项】
1.冠状病毒通用的核酸检测技术，可采用普通逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征是可以检出甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒。
2.冠状病毒通用的核酸检测技术，其特征有两个:一是可以检出甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒；二是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应。
3.冠状病毒通用的核酸检测技术，其特征有三个:一是可以检出甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒；二是采用针对冠状病毒Ib基因保守的区域而设计的一对引物；三是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应。
4.冠状病毒通用的核酸检测技术，可采用逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征有两个:一是可以检出甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为tgggttgggaytaycctaartgtga，或与 tgggttgggaytaycctaartgtga 序列有 15 个或 15 个以上的碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，y和r是简并碱基，y表示t和c的混合物，r表示g和a的混合物)。
5.冠状病毒通用的核酸检测技术，可采用逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征有两个:一是可以检出甲、乙、丙、丁等四个属的冠状病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为tgytgtgarcaraaytcatgwgg,tgytgtgarcaraaytcatgwgg15 S? 15 -t Stl碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，y、r和w是简并碱基，y表示t和c的混合物，r表示g和a的混合物，w表示a或t的混合物)。
6.冠状病毒通用的核酸检测技术，其特征有三个:一是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应；二是检测反应采用的两条引物，其序列分别为ccagttggwggtaatgaaaa 矛口 gttgacagcatgttraacatkcccat，15 15以上的碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，w、r和k代表简并碱基，w表示碱基a和碱基t的混合物，r表示碱基g和碱基a的混合物，k表示碱基g和碱基t的混合物)。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，它确立了甲冠状病毒属、乙冠状病毒属、丙冠状病毒属、丁冠状病毒属等冠状病毒的通用核酸检测方法，含有三个技术要点：①确立了核酸检测所需要的引物序列；②确立了检测反应种类；③确立了检测反应体系和反应条件。该通用核酸检测方法可以用于冠状病毒科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。
【IPC分类】C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104818344
【申请号】CN201510250986
【发明人】庄青叶, 王素春, 王楷宬, 刘朔, 陈继明
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月18日