0] 在多种实施方式中，所述编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接动质体寄生 原生动物的活跃转录基因的5'UTR和3'UTR(未翻译区或非翻译区）。优选地，所述编码异 源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接锥体虫目的成员的活跃转录基因的5' UTR和3' UTR ; 更优选地，侧翼连接利什曼虫属的成员的活跃转录基因的5' UTR和3' UTR ;更优选地，侧翼 连接蜥蜴利什曼原虫的活跃转录基因的5' UTR和3' UTR。
[0051] 在多种实施方式中，所述编码异源C因子蛋白的多聚核苷酸侧翼连接一个或多个 信号序列，这些信号序列提供了，比如，动质体寄生原生动物的活跃转录的基因的有效分 泌、剪接和/或多聚腺苷酸化，即，所述信号序列为动质体寄生原生动物的活跃转录基因的 信号序列。优选地，所述异源C因子蛋白侧翼连接锥体虫目的成员的活跃转录基因的一个 或多个信号序列；更优选地，侧翼连接利什曼虫属的成员的活跃转录基因的一个或多个信 号序列；更优选地，侧翼连接蜥蜴利什曼原虫的活跃转录基因的一个或多个信号序列。
[0052] 在多种实施方式中，所述异源C因子蛋白侧翼连接来源于墨西哥利什曼 原虫（Leishmania mexicana)的酸性磷酸酶的信号序列（Wiese等.1995，EMBO J.14:1067-1074)。
[0053] 在多种实施方式中，本发明的表达系统实质上不产生宿主细胞的蛋白酶、毒素和 大量其他内源合成以及分泌的蛋白。
[0054] C因子的核酸和氨基酸序列及其变体
[0055] 由在本发明中所使用的多聚核苷酸编码的C因子蛋白是一种异源C因子蛋白。在 本发明中所使用的多聚核苷酸包含编码C因子的核酸序列，所述核酸序列呈现出像来源于 鲎的C因子的酶活性。本发明的范围包括编码C因子的多聚核苷酸的用途，所述C因子具 有如在它的自然来源中发现的氨基酸序列，即，从鲎中获得的C因子的氨基酸序列，也包括 编码如在本文中描述的C因子氨基酸序列的变体的多聚核苷酸的用途。本发明的范围也包 括含有如在它的自然来源中发现的C因子核酸序列的多聚核苷酸的用途，即，从鲎中获得 的C因子的核酸序列，也包括含有如在本文中描述的变体C因子核酸序列的多聚核苷酸的 用途。不管怎样，在本发明中所使用的多聚核苷酸编码C因子蛋白，当用内毒素激活时该蛋 白显示出C因子样的酶活性。在本文其它地方给出"C因子样的酶活性"的定义。
[0056] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的编码C因子蛋白的多聚核苷酸通过插 入、删除、添加和/或取代一个或更多个核酸进行修饰，条件是在根据本发明的寄生原生动 物宿主细胞中从这样修饰的多聚核苷酸的表达获得的C因子蛋白在用内毒素、胰凝乳蛋白 酶（特别是a-胰凝乳蛋白酶）或脂质A激活时显示出C因子样的酶活性。
[0057] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸为编码来源于中国鲎 (Tachypleus tridentatus)或南方豐（Tachypleus gigas)的C因子的多聚核苷酸。在多 种实施方式中，所述多聚核苷酸编码来源于圆尾豐（Carcinoscorpius rotundicauda)的C 因子。在多种实施方式中，所述多聚核苷酸编码来源于美洲豐（Limulus polyphemus)的C 因子。在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸包含序列表中SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
[0058] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸与编码具有SEQIDN0:4的 氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸至少具有75%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活 性的多肽。优选地，所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQIDN0:4的氨基酸序列的多肽 的多聚核苷酸具有至少85%或至少95%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多 肽。更优选地，所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQIDN0:4的氨基酸序列的多肽的多 聚核苷酸具有至少96%或至少97%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。 甚至更优选地，所述多聚核苷酸呈现出与编码具有SEQIDN0:4的氨基酸序列的多肽的多 聚核苷酸具有至少98%或至少99%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
[0059] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸编码一种多肽，所述多肽具 有的氨基酸序列与SEQ ID N0:4的氨基酸序列有至少75%同一性并且呈现出C因子样的酶 活性。优选地，所述多聚核苷酸编码一种多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:4 的氨基酸序列有至少85%或至少95%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。更优选地，所 述多聚核苷酸编码一种多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:4的氨基酸序列有 至少96%或至少97%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。甚至更优选地，所述多聚核苷 酸编码一种多肽，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:4的氨基酸序列有至少98%或 至少99%同一性并且呈现出C因子样的酶活性。
[0060] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸为在严格条件下与在本文中 所描述的任意多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸，其中所述杂交多聚核苷酸编码呈现出C因子 样的酶活性的多肽。
[0061] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的核苷酸序列有至少75%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。优选 地，在本发明中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少 85%或至少95%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。更优选地，在本发明 中所使用的多聚核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少96%或至少 97%的同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。甚至更优选地，在本发明中所使 用的多聚核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列有至少98%或至少99%的 同一性，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽。
[0062] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸含有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的核苷酸序列有至少75%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分，并且编 码呈现出C因子样的酶活性的多肽，其中所述部分编码具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4 的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物，并且其中所述片段、类似物或功能衍生 物呈现出C因子样的酶活性。优选地，所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3 的核苷酸序列有至少85%或至少95%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一部分，并 且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽，其中所述部分编码具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物，并且其中所述片段、类似物或功能 衍生物呈现出C因子样的酶活性。更优选地，所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的核苷酸序列有至少96%或至少97%的同一性的多聚核苷酸的核苷酸序列的一 部分，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽，其中所述部分编码具有SEQ ID N0:2或 SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物，并且其中所述片段、类似 物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。甚至更优选地，所述多聚核苷酸含有与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的核苷酸序列有至少98%或至少99%的同一性的多聚核苷酸的核苷 酸序列的一部分，并且编码呈现出C因子样的酶活性的多肽，其中所述部分编码具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽的片段、类似物或功能衍生物，并且其中所述片 段、类似物或功能衍生物呈现出C因子样的酶活性。
[0063] 在多种实施方式中，在本发明中所使用的多聚核苷酸为在本文中描述的并且在本 发明中可使用的任意多聚核苷酸的全长的互补，其中所述互补多聚核苷酸编码呈现出C因 子样的酶活性的多肽。
[0064] 本发明特别包含编码如在W0 99/15676中描述的来源于圆尾鲎 (Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子的核酸序列的用途。具体地，本发明通过引用 方式包括以W099/15676的SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3形式表示的代表性核苷酸序列的 用途。同样地，W0 99/15676的SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4的氨基酸序列（分别表示由 TO 99/15676的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码的氨基酸序列）的用途明 确地通过引用的方式包括在本发明中。
[0065] W0 99/15676的SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:4的序列不对应于本说明书的序列表 的SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:4。无论何时在本发明中涉及SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:4 的任意序列，是指本说明书的序列表的SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:4的任意序列。相反地， 如在前面段落中所示的，W0 99/15676的SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:4的序列通过明确引 用TO99/15676而在本文中表述。
[0066] 本发明的范围包括重组制备由在本文描述的任意多聚核苷酸和核酸分子编码的C 因子多肽。当然，本发明的范围也包括从任意这种制备过程获得的重组C因子多肽。
[0067] 在多种实施方式中，本发明的C因子蛋白的氨基酸序列由插入、删除、添加和/或 取代一个或多个氨基酸残基进行修饰，条件是在根据本发明的寄生原生动物宿主中重组表 达后的具有这样修饰的氨基酸序列的C因子蛋白在用内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活 时显示出C因子样的酶活性。
[0068] 前面句子中的术语"一个或多个氨基酸残基"的意思随着C因子蛋白的三维结构 中氨基酸残基的位置和氨基酸残基的类型而变化。更具体地，所述术语指优选为1-20个氨 基酸残基，更优选为1-10个氨基酸残基，更优选为1-5个氨基酸残基，并且甚至更优选为 1-3个氨基酸残基。在多种实施方式中，上述描述的插入、删除、添加和/或取代一个或多 个氨基酸是保持了由内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A以酶原形式激活的C因子蛋白的酶活 性的保守突变。示例性的保守突变为保守取代。保守取代为，比如，如果取代位点为芳香族 氨基酸，在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸间互相发生取代的突变；如果取代位点为疏水性氨基 酸，在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸间互相发生取代的突变；如果取代位点为极性氨基酸，在 谷氨酰胺和天冬酰胺间互相发生取代的突变；如果取代位点为碱性氨基酸，在赖氨酸、精氨 酸和组氨酸间互相发生取代的突变；如果取代位点为酸性氨基酸，在天冬氨酸和谷氨酸间 互相发生取代的突变；以及如果取代位点为含有羟基基团的氨基酸，在丝氨酸和苏氨酸间 互相发生取代的突变。被认为是保守取代的取代的例子具体包括用丝氨酸或苏氨酸取代丙 氨酸，用谷氨酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸，用谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸或天 冬氨酸取代天冬酰胺，用天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸，用丝氨酸或丙氨酸取 代半胱氨酸，用天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺，用甘 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸，用脯氨酸取代甘氨酸，用天冬酰 胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或酪氨酸取代组氨酸，用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或苯丙氨 酸取代异亮氨酸，用异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代亮氨酸，用天冬酰胺、谷氨 酸、谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸取代赖氨酸，用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸取代甲 硫氨酸，用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸，用苏氨酸或丙氨酸 取代丝氨酸，用丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸，用苯丙氨酸或酪氨酸取代色氨酸，用组氨酸、 苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸，以及用甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代缬氨酸。
[0069] 本发明包含对SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的任意的上面描述的插 入、删除、添加和/或取代。
[0070] 上面描述的插入、删除、添加和/或取代也包括由于C因子基因来源的鲎之间个体 的品系或种类的不同而自然发生的突变。此外，上面描述的插入、删除、添加和/或取代也 包括在单独的宿主细胞中C因子蛋白的重组表达过程中自然发生的突变。
[0071] 在多种实施方式中，由本发明的方法制备的C因子蛋白具有来源于中国鲎 (Tachypleus tridentatus)或南方豐（Tachypleus gigas)的C因子的氨基酸序列。在多 种实施方式中，由本发明的方法制备的C因子蛋白具有来源于圆尾豐（Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子的氨基酸序列。在多种实施方式中，由本发明的方法制备的C因子 蛋白具有来源于美洲豐（Limulus polyphemus)的C因子的氨基酸序列。在多种实施方式 中，由本发明的方法制备的C因子蛋白具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列。
[0072] 在多种实施方式中，在本发明中所用的多聚核苷酸编码具有SEQ ID N0:4的氨基 酸序列多肽或其片段、类似物或功能衍生物，其中所述片段、类似物或功能衍生物呈现出C 因子样的酶活性。本发明包括本文描述的任意C因子多肽的片段、类似物和/或功能衍生 物，只要这种片段、类似物和/或功能衍生物在用内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活时显 示出C因子样的酶活性。
[0073] 为了根据本发明的鲎C因子的重组制备，所述寄生原生动物包含编码来源于鲎的 重组C因子蛋白的多聚核苷酸。因此，编码在本发明中所使用的来源于鲎的C因子蛋白的 多聚核苷酸为一种异源多聚核苷酸，更具体地为一种编码来源于鲎的异源C因子蛋白的异 源多聚核苷酸。
[0074] 为了清楚起见，在本文中描述的鲎C因子蛋白的任意变体仍被认为是鲎C因子蛋 白，并不考虑在本文中描述的任意变体被定义为呈现出鲎C因子样的酶活性的事实。
[0075] C因子样的酶活性
[0076] 酶原是酶的前体。虽然酶原有时被称为酶的非活性前体，在它（由于不同的因素） 已失去其活性的意义上，酶原不是"非活性"的，而是一种需要被激活而成为有活性的酶的 分子。
[0077] 来源于鲎的C因子仍然是一种酶原直至遇到痕量的内毒素。当被内毒素（或胰凝 乳蛋白酶或脂质A)激活时，鲎C因子明确地呈现出完全的酶活性，通过水解合成的C因子 底物指示（比如，在待分析内毒素的样品中）内毒素的存在，所述合成的C因子底物形成可 测量/可检测的产物。本发明的重组C因子（rFC)以像从其自然来源的C因子一样的酶原 进行制备。此外，本发明的rFC也仍然为一种酶原直至它遇到痕量的内毒素。当被内毒素 (或胰凝乳蛋白酶或脂质A)激活时，本发明的rFC明确地呈现出像从其自然来源的鲎C因 子一样的完全的酶活性。
[0078] 从上面看，并且仅为了清楚起见，需要注意的是"C因子样的酶活性"是指如为激 活形式测得的来源于鲎的C因子的酶活性。换句话说，"C因子样的酶活性"是指被内毒素、 胰凝乳蛋白酶或脂质A激活的鲎C因子的酶活性。因此，如果由本发明的方法制备的重组 C因子蛋白在本文中被描述为具有或呈现出C因子样的蛋白酶活性，应当清楚的是它是指 激活的酶原的酶活性。换句话说，如在本文中所使用的"来源于鲎的C因子的酶活性"是指 "来源于鲎的激活的C因子的酶活性"或"来源于鲎的激活的C因子酶原的酶活性"。
[0079] 在多种实施方式中，术语"本发明的（重组）C因子"和"本发明的酶原（重组）C 因子"可以交替地使用。虽然从本发明的方法直接获得的rFC为C因子酶的前体，在它（因 为不同因素）已经失去其活性的意义上，本发明的酶原rFC不是"非活性"的。相反地本发 明的酶原rFC是需要被激活以成为有活性的酶的分子。
[0080] 来源于鲎的C因子的酶活性具体为水解活性，更具体为蛋白水解活性，并且更具 体为丝氨酸蛋白酶活性。因此，如在本文中描述的C因子样的酶活性具体是指鲎C因子样 的水解活性，更具体为鲎C因子样的蛋白水解活性，并且更具体为鲎C因子样的丝氨酸蛋白 酶活性。
[0081] 鲎C因子蛋白的酶活性可以通过如发色或荧光分析来测量。具体地，鲎C因子 的酶活性可以通过如可检测的发色或荧光信号来证实，该信号是由于被激活的C因子分 裂/水解C因子底物产生的。用于检测C因子活性的合适的分析在本领域中有描述，并且 本领域普通技术人员在进行指定的C因子蛋白的酶活性的检测/测量分析时不会有任何 问题。C因子的底物在本领域中也有描述并且可以利用。本发明的范围包括发色或荧光C 因子底物的用途，所述发色或荧光C因子底物包括但不限于，发色的肽基对硝基苯胺底物 和荧光的肽基-AMC，肽基-AFC以及肽基-MCA底物。示例性的C因子底物包括但不限于， N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-MCA、N-t-Boc-VPR-AMC、Mu-VPR-AFC 以及 Boc-VPR-pNA〇
[0082] 在多种实施方式中，由本发明提供的rFC呈现出具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列 的鲎C因子的酶活性，更具体为具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的鲎C因子的水解活性，更 具体为具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的鲎C因子的蛋白水解活性，并且甚至更具体为具 有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的鲎C因子的丝氨酸蛋白酶活性。
[0083] 双链酶原形式的C因子
[0084] 酶原形式的鲎的C因子已知含有一条重⑶链和一条轻（L)链（因此叫做双链形 式）。本发明的重组C因子也以双链酶原形式制备。具体地，从由本发明提供的方法获得的 酶原C因子也包含一条H链和一条L链。因此，如在上文所提及的，术语"本发明的C因子" 和"本发明的酶原C因子"可以交替使用。或者，"本发明的酶原（zymogen)(重组）C因子" 可以命名为"本发明的酶原（proenzyme)(重组）C因子"。无论如何，从本发明的方法直接 获得的重组C因子的特征为含有一条重（H)链和一条轻（L)链的双链酶原形式。
[0085] 在主要氨基酸序列的基础上计算的SEQ ID N0:4的C因子蛋白的分子量为 110kDa(109. 7kDa)。本发明的范围包括其中本发明的重组C因子具有修饰的主要氨基酸序 列（如，N或C末端的截短）的实施方式。在这种情况下，在主要序列的基础上计算的分子 量被改变了。因此，本发明的范围包括具有在主要氨基酸序列的基础上计算的以下分子量 的重组C因子蛋白：在90至130kDa之间范围内的任意分子量，优选地在95至125kDa之间 范围内的任意分子量，更优选地在100至120kDa之间范围内的任意分子量，并且更优选地 在105至115kDa之间范围内的任意分子量。甚至更优选地，本发明的重组C因子蛋白具有 在主要氨基酸序列的基础上计算的在108至112kDa范围内的分子量。
[0086] 令人惊讶的是，用SDS-PAGE测定的酶原形式的C因子的分子量结果低于在主要氨 基酸序列的基础上计算的分子量。具体地，由根据本发明的方法制备的酶原形式的C因子 具有在非还原条件下通过SDS-PAGE测定的102kDa的分子量。此外，由根据本发明的方法制 备的酶原形式的C因子具有在还原条件下通过SDS-PAGE测定的106kDa(包括糖基化）的 分子量，其产生于H链测定的69kDa的分子量和L链测定的37kDa的分子量。因此，本发明 包括具有在非还原条件下通过SDS-PAGE测定的约102kDa的分子量的重组C因子蛋白，以 及具有在还原条件下通过SDS-PAGE测定的约106kDa(包括糖基化）的分子量的重组C因 子蛋白。
[0087] 当在内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A的存在下激活C因子时（C因子自身催化转变 成激活形式），L链中发生分裂，导致出现两个新片段，一条B链和一条A链。因此，本发明 的重组C因子进一步的特征为通过内毒素、胰凝乳蛋白酶或脂质A激活从本发明的方法直 接获得的酶原形式（C因子自身催化转变成激活形式）导致由于酶原C因子的L链的分裂 而产生含有一条B链和