。
[0185] 在多种实施方式中，所述试剂盒进一步包括增加内毒素检测灵敏性的表面活性 剂。所述表面活性剂和所述C因子蛋白可以以分离的容器存在于所述试剂盒中。
[0186] 在多种实施方式中，所述试剂盒包含一个含有本发明的组合物或溶液的单独的容 器，所述组合物或溶液包含本发明的重组C因子和如在本文其它地方描述的表面活性剂。
[0187] 在多种实施方式中，包含在试剂盒中的所述表面活性剂为两性表面活性剂。在多 种其它实施方式中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。在多种 其它实施方式中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。优选地，所述表面活性剂选自 由 ZWITTERGENT 3-14、Triton X-100、Triton X-114、辛基-0-D-硫代葡萄糖苷、Genapol C-100、吐温20以及吐温80组成的组。优选地，所述表面活性剂在试剂盒中的浓度为0. 001 至0. 5%，更优选为0. 001至0. 025%的浓度，更优选为0. 001至0. 01 %的浓度。在多种实 施方式中，所述表面活性剂在试剂盒中的浓度为〇. 004至0. 006%。这包括在分开的容器或 本发明的组合物或溶液中存在的表面活性剂，所述组合物或溶液既包含本发明的重组C因 子也包含所述表面活性剂。
[0188] 在多种实施方式中，包含所述表面活性剂的容器是包含含有另外的表面活性剂的 缓冲液的容器。
[0189] 在多种实施方式中，所述试剂盒进一步包含C因子底物。具体地，通过激活的C因 子（即，如在本文其它地方描述的在内毒素或脂质A的存在下自身催化的激活）的水解活 性分裂C因子底物产生可检测的信号。优选地，所述试剂盒包含发色和/或荧光C因子底 物。在多种实施方式中，所述C因子底物为发色的肽基对硝基苯胺底物。在多种其它实施 方式中，所述C因子底物为荧光的肽基-AMC、肽基-AFC或肽基-MCA底物。进一步地，示例 性的 C 因子底物包括但不限于：N-t-Boc-DPR-AMC、N-t-Boc-VPR-AMC、N-t-Boc-VPR-MCA、 Mu-VPR-AFC 以及 Boc-VPR-pNA〇
[0190] 产生制备重组C因子的寄生原生动物宿主细胞的过程
[0191] 本发明提供一种用于产生制备重组C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法， 包括步骤：(a)将含有编码异源鲎C因子的多聚核苷酸的核酸分子（优选为载体或质粒）引 入至寄生原生动物宿主细胞，和（b)选择一个或多个在步骤（a)中制备的表达所述C因子 蛋白的宿主细胞。优选地，将根据本发明的载体或质粒引入至寄生原生动物宿主细胞，即， 含有编码异源鲎C因子蛋白的核酸分子的载体或质粒。此外，所述寄生原生动物宿主细胞 优选为动质体寄生原生动物宿主细胞。更优选地，所述动质体寄生原生动物宿主细胞为复 殖的锥体虫（即，锥体虫目的复殖成员）。更优选地，所述寄生原生动物宿主细胞为锥体虫 目的细胞。甚至更优选地，所述寄生原生动物宿主细胞为利什曼虫属的细胞。最优选地，所 述寄生原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。
[0192] 本发明也提供由上述用于产生制备重组C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的 方法获得的寄生原生动物宿主细胞，其中所述寄生原生动物宿主细胞含有编码异源鲎C因 子的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸由引入至所述寄生原生动物宿主细胞的核酸分子 (优选为载体或质粒）组成。优选地，所述寄生原生动物宿主细胞含有根据本发明的载体或 质粒，即，含有编码异源鲎C因子蛋白的核酸分子的载体或质粒。此外，所述寄生原生动物 宿主细胞优选为动质体寄生原生动物宿主细胞。更优选地，所述动质体寄生原生动物宿主 细胞为复殖的锥体虫（即，锥体虫目的复殖成员）。更优选地，所述寄生原生动物宿主细胞 为锥体虫目的细胞。甚至更优选地，所述寄生原生动物宿主细胞为利什曼虫属的细胞。最 优选地，所述寄生原生动物宿主细胞为蜥蜴利什曼原虫。
[0193] 细胞系
[0194] 本发明也提供由公开的载体和/或质粒获得的稳定转染的细胞系。优选地，所述 转染的细胞系为从动质体寄生原生动物细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地，所述转 染的细胞系为从锥体虫目的细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地，所述转染的细胞系 为从利什曼虫属的细胞的稳定转染获得的细胞系。更优选地，所述转染的细胞系为从蜥蜴 利什曼原虫种类的细胞的稳定转染获得的细胞系。
[0195] 其它一般定义
[0196] 总体来说，在本文中无论何时涉及根据本发明的方法制备的C因子，或"根据本发 明的方法获得的C因子"，或仅是"本发明的C因子"，这样的涉及包括本发明的所述C因子 的任何片段、类似物或功能衍生物，所述任何片段、类似物或功能衍生物具有C因子样的酶 活性，即，类似于在本文其它地方描述的来源于鲎的C因子的酶活性。
[0197] 在本发明中，"序列同一,性的百分比（％ ) "是通过在比较窗（comparison window) 上比较两条最优排列的序列所测定的，其中对于两条序列的最优排列，在比较窗里多聚核 苷酸序列的部分可能包括与对照序列（不包括添加或删除）相比的添加或删除（即，间 隔）。通过测定同样的核酸碱基或氨基酸残基在两条序列中均出现的位置的数量以产生配 对位置的数量，将配对位置的数量除以比较窗中位置的总数量以及将该结果乘以100以产 生序列同一性的百分比计算得到所述百分比。在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中， 术语"同一性"或"同一性"百分比是指当在比较窗中比较和排列出最大相应性时，相同的 两条或更多条序列或子序列，或者具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两条或 更多条序列或子序列，或者具有使用下面的序列比较运算法则的一种或通过人工排列和肉 眼检查测量的选定区域的序列或子序列。这样的序列之后被叫作"基本同一的"。该定义也 指测试序列的互补序列。任选地，所述同一性存在于长度上至少大约50个氨基酸或核苷酸 的区域，或更优选地存在于长度上为75-100个氨基酸或核苷酸的区域。
[0198] 为了序列比较，通常一条序列作为对照序列，测试序列与其相比较。当使用序列比 较运算法则时，将测试序列和对照序列输入计算机中，（如果需要）选定子序列坐标，并选 定序列运算法则程序参数。可以用默认的程序参数，或可以选定可选参数。基于程序参数， 序列对比运算法则之后计算测试序列相对于对照序列的百分比序列同一性。术语核酸分子 和核酸序列可以在本文中可交替地使用。
[0199] 如在本文中所讨论的，存在本发明的蛋白和多肽的大量变体。蛋白变体和衍生物 对于本领域技术人员来说是很好理解的，并且可以包括氨基酸序列修饰。比如，氨基酸序列 修饰通常落入三类中的一种或多种：取代的、插入的或删除的变体。插入包括氨基和/或 羧基末端融合，也包括单个或多个氨基酸残基的序列内插入。删除的特征在于从蛋白序列 去除一个或多个氨基酸残基。通常，根据本发明，删除在蛋白分子内的任何一个位点的不多 于大约2至6个残基。这些变体一般通过编码蛋白的多聚核苷酸的DNA中的核苷酸的定 点突变制备，由此制备编码变体的DNA，并且之后根据本发明在重组细胞培养物中表达所述 DNA〇
[0200] 用于在具有已知序列的DNA的预定位点进行取代突变的技术对于本领域的技术 人员是熟知的。氨基酸取代通常为单个残基的，但可以一次发生在多个不同位点上；插入通 常会按照大约1至10个氨基酸残基的规则；删除会在大约1至30个残基的范围。删除或 插入优选地在邻近对进行，比如，2个残基的删除或2个残基的插入。取代、删除、插入或其 任何结合可以联合起来以得到一个最终的构造。突变必须不能位于源自读码框的序列，并 且优选地不能制造出可能产生二级mRNA结构的互补区域。取代变体是其中至少一个氨基 酸残基已被去除并且一个不同的氨基酸残基插入到该位置因此获得保守取代的那些。保守 取代的意思对于本领域的技术人员是熟知的。
[0201] 某些翻译后修饰是本发明的重组宿主细胞在所表达的多肽上进行的结果。谷氨酰 胺酰残基和天门冬酰氨酰基残基常常翻译后脱酰胺基成对应的谷氨酰残基和天门冬酰残 基。或者，这些残基在适度酸性条件下脱酰胺基。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的 羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的〇-氨 基的甲基化，N末端氨基的乙酰化，以及，在某些情况下，C末端羧基的酰胺化。这种翻译后 修饰也考虑在本发明中。
[0202] 术语"蛋白"和"多肽"在本发明中可交替地使用。术语"C因子蛋白"和"C因子 多肽"相应地可以在本文中交替地使用。
[0203] 当在本文中描述本发明的【具体实施方式】时，说明书的相应的段落/文本的段落总 是引用在说明书中其它地方描述的方式和/或方法。在这种语境下，使用像"根据本发明"、 "本发明的"以及"由本发明提供的"这些术语。这是指当在某个段落或文本段落中描述本 发明的【具体实施方式】时，引用在本说明书中其它地方描述的"根据本发明"或"本发明的"方 式和/或方法。对于所描述的一种【具体实施方式】，这种引用意于包括对于所述的具体实施 方式的所有方式和/或方法，这些方式和/或方法在本说明书的其它地方描述，并且由本发 明提供以及因此成为本发明的部分范围。例如，如果一种【具体实施方式】的描述涉及"根据本 发明的C因子"或"本发明的C因子"，或"由本发明的方法制备或获得的C因子"，这是指在 说明书中其它地方描述的、由本发明提供的并因此形成本发明的部分范围的所有C因子蛋 白可以应用于那种具体的实施方式。这特别应用于（比如）根据本发明的C因子蛋白的片 段和变体中，所述片段和变体在本发明中定义，并且其可应用于遍及申请文本所描述的多 种实施方式中。
[0204] 上面的原则应用于使用像"根据本发明"、"本发明的"和/或"由本发明提供的"术 语的所有实施方式。不言而喻，不是在本文描述的每个实施方式都可以特定涉及本发明的 所有方式和/或方法，这些方式和/或方法已经在说明书的其它地方定义，并且其可应用于 遍及申请文本所描述的多种实施方式中。否则，每一个专利申请会包括几百页的说明书。
[0205] 此外，像"在多种实施方式中"和"在多种其它/进一步的实施方式中"的术语明 显是指"在本发明的多种实施方式中"和"在本发明的多种其它/进一步的实施方式中"。
[0206] 本发明由下面的实施例进行举例说明，这些实施例仅是解释型且不应该理解为用 任何方式或以任何程度限制本发明的范围。
[0207] 实施例
[0208] 实施例1、将C因子基因克隆到表达载体并转化E. coli DH 5 a
[0209] 将C因子基因克隆到表达载体的起点是来源于中国豐（Tachypleus tridentatus)的C因子序列（NCBI登录号P28175. 1 ;其中参考文献1 :Muta等.1991，工 Biol. Chem. 266(10) :6554-6561)。如在登录号P28175. 1下显示的来源于中国鲎的野生型 C因子蛋白的氨基酸序列具有1019个氨基酸残基的长度。在蛋白的表达和分泌后分离下 来的前导序列具有25个氨基酸残基的长度（在登录号P28175. 1下显示的氨基酸序列的第 1至25个残基）。没有前导序列的来源于中国鲎的野生型C因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码如SEQ ID NO:2所示的来源于中国鲎的野生型C因子蛋白的核苷酸序 列以SEQ ID N0:1给出。
[0210] 为了在利什曼虫属中表达，对中国鲎SEQ ID NO: 1的序列进行密码子优化。所产 生的密码子优化的序列如SEQ ID NO: 3所示。由密码子优化过的SEQ ID NO: 3的核苷酸序 列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。密码子优化不引起原始野生型C因子蛋白的氨 基酸序列的改变。因此，SEQ ID N0:4的氨基酸序列与SEQ ID N0:2的氨基酸序列一样。
[0211] 将密码子优化的SEQIDN0:3的序列克隆到表达载体中，并且将所得到的质粒随 后转化到E.coliDH5a。
[0212] 实施例2、利什曼虫属的转染和克隆的选择
[0213] 用于转染的表达载体的制备
[0214] 制备含有密码子优化的SEQ ID NO:3序列以及用于目标蛋白在利什曼虫属宿主细 胞中的分泌表达的信号肽序列的利什曼虫属宿主细胞特异性表达载体。来源于蜥蜴利什曼 原虫（Leishmania tarentolae)的分泌信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。利 什曼虫属前导序列在蛋白的表达和分泌后分离下来。
[0215] 利什曼虫属细胞的转染
[0216] 广泛范围的锥体虫的稳定的DNA转染（包括用电穿孔的利什曼虫属的转染）在 本领域中已有描述（Beverly 和Clayton 1993，Methods Mol.Biol.21:333_348;Coburn 等.1991，Mol. Biochem. Paras itol. 46:169-179)。此处，采用用于转染的高压方案（Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany)进行利什曼虫属细胞的培养和转染。具体地，培养从预培 养获得的利什曼虫属细胞（蜥蜴利什曼原虫）直至达到大约6X10 7个细胞/ml的细胞密 度（OD 1.4)。通过显微镜确保细胞是活的并且是滴样的形状。将预冷的细胞加入至含有 〇. l_5yg的转化DNA试管中（冰上），混合，并转移到电穿孔小管中（冰上）。使用用脉冲 控制器的基因脉冲（gen印ulser)，在1500V，25 y F下脉冲2次，脉冲间隔10秒（脉冲时间 约0. 3毫秒）。将小管放回冰上10分钟，并将电穿孔的细胞转移到通风的组织培养瓶中，随 后以静态悬浮培养在26°C孵育过夜（大约20小时，0. D. 0. 3-0. 4)。
[0217] 克隆的选择
[0218] 通过在添加有选择性抗生素的固体培养基上铺平板完成克隆的选择。单克隆之后 在选择性培养基中扩增。为了此目的，上至10个克隆在每个培养瓶中以l〇ml进行培养。这 些培养物用于评价。
[0219] 分离基因组DNA，用特异针对重组C因子基因的寡聚核苷酸通过PCR确认重组C因 子基因的插入。
[0220] 通过用含有用于表达诱导的10 y g/ml的四环素的新鲜培养基以1 :10稀释培养物 分析基因表达。培养物在26°C黑暗生长3至4天。收获细胞（3000Xg，4°C，10分钟）。通 过三氯乙酸（TCA)沉淀浓缩上清液中的蛋白，并用SDS-PAGE分析。
[0221] 实施例3、重组C因子蛋白的表达和纯化
[0222] 在锥体虫原生动物（特别在利什曼虫属）中重组蛋白的表达在本领域中已 有描述（Breitling 等.ZOC^Protein Expression and Purification 25:209-218; Basile 和 Peticca 2009，Mol.Biotechnol.43:273_278)。此处，用由 Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany提供的基因表达试剂盒进行用于C因子蛋白的表达和纯化的利什曼虫 属的培养和工程操作。
[0223] 3. 1生产株的维持
[0224] 生产株以10ml的体积在培养瓶中26°C黑暗培养。将生产株每2至3天以1 :20或 1:50连续稀释到含有用于选择被插入基因的所有添加剂和抗生素的新鲜培养基中。
[0225] 3个月之后，丢弃所培养的株，从新鲜丙三醇储备物中开始新的培养。
[0226] 3. 2表达
[0227] 通过用新鲜培养基以1:50稀释生产株以及在培养瓶中26°C黑暗培养2至3天建 立预培养物。
[0228] 向锥形烧瓶中的1. 51的含有用于表达诱导的四环素的培养基中接种30ml预培养 物。表达发生在26°C下黑暗和105rpm振荡68至72小时时。当培养基中的葡萄糖浓度降 到650mg/L以下时，加入血晶素和葡萄糖，并将培养物另外培养86至72小时。
[0229] 收获细胞（4000Xg，4°C，30分钟）。将上清液在-20°C冷冻或直接用于重组C因 子的纯化。
[0230] 3. 3 纯化
[0231] 3. 3.1阳离子交换层析
[0232] 来自表达的上清液直接使用或渐渐解冻。在加入2mM EDTA之后，用pH 5的20mM 乙酸钾、2mM EDTA稀释上清液直至达到pH5. 0至5. 5且电导率〈5. 5mS/cm。
[0233] 用阳离子交换层析进行纯化。采用SP650M柱，以pH 5的25mM乙酸钾、2mM EDTA 作为平衡缓冲液，并以pH 5的25mM乙酸钾、2mM EDTA、ImM氯化钾作为洗提缓冲液。
[0234] 在上样上清液后，首先用平衡缓冲液洗柱，然后用10%洗提缓冲液洗柱。洗提发生 在50 %洗脱缓冲液时。
[0235] 3. 3. 2蛋白分析
[0236] 使用凝胶过滤和SDSPAGE分析含有蛋白的组分的浓度和纯度。
[0237] 对于凝胶过滤，将50 y 1各组分以0. 75ml/min上样到TSK3000 PW柱。在220nm 跟踪吸收。rFC在7. 4+/-0. 4分钟的保留时间处以峰最大值洗脱。
[0238] 仅将满足下面标准的组分合并：
[0239] 1)保留时间为6. 4+/-0. 4分钟的峰的峰面积必须不超过rFC峰面积的10%。
[0240] 2)保留时间为10. 3+/-0. 5分钟的峰的峰面积必须不超过rFC峰面积的350%。
[0241] 3)rFC峰和保留时间为10. 3+/-0. 5分钟的峰之间的最小值必须在9和10分钟之 间，并且最小吸收值必须不超过rFC峰的最大吸收值的30%。
[0242] 每个组分中rFC的浓度在rFC标准曲线的帮助下通过峰面积测定。最终合并物的 浓度必须为至少50 y g/ml rFC。
[0243] 3. 3. 3 透析
[0244] 将ImM PMSF加入到rFC合并物中，并在室温下培养4小时。随后加入0. 1%的 Pluronic? F-127,将溶液用 pH 5 的 5 升 5mM 乙酸钾、lOOmM 氯化钾、0? 1 % Pluronic? F-127、0. 05mM EDTA在4°C透析。透析进行3次每次12小时。
[0245] 第三次透析后，将rFC溶液离心（4000 X g，4°C，1小时），将上清液用pH5的5升 5mM 乙酸钾、lOOmM 氯化钾、0? l%Pluronic? F-127、0.05mM EDTA 在 4°C再次透析至少 12 小 时。
[0246] 3. 3. 4 贮存
[0247] 透析的rFC溶液进行无菌过滤，并且通过凝胶过滤测定浓度，并用SDS凝胶测定纯 度。溶液在4°C贮存。
[0248] 实施例4、在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的比活的测定
[0249] 根据 Ding 等? 1993 (Biochimica et Biophysica Acta 1202:149-156)中描述的 分析测定C因子的比活。这个文献已经在美国专利US 5, 712，144中引用用于分析，其用于 测定从圆尾豐（C. rotundicauda)分离的C因子蛋白的比活。
[0250] 具体地，首先用反应缓冲液加LPS稀释在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的系列 稀释。该反应缓冲液含有50mM Tris、100mM NaCl以及50mM MgCl2，并用无内毒素的超纯水 制备。
[0251] LPS从LPS储存液（溶解在无内毒素的超纯水中的LPS)加入到反应缓冲液。
[0252] 用制备的稀释液装载微量滴定板，并在37°C培养1小时。随后，将C因子蛋白的底 物加入孔中，之后将微量滴定板在37°C培养15分钟。所用的底物为Boc-Val-Pro-Arg-AMC， 其是C因子蛋白的荧光底物。Boc-VPR-AMC溶解在无内毒素的超纯水中以制备底物溶液，该 底物溶液用于制备底物溶液的稀释液，该稀释液应用于分