析。
[0253] 在通过加入冰醋酸停止反应后测量荧光（RFU)。在37°C下底物转换15分钟后测 得的rfu值总结在下面表1中。
[0254] 表1 :在37°C下底物转化15分钟后测得的rfu值
[0255]
[0256] 表1显示了在减去背景rfu值后具有高于背景的信号的LPS激活的rFC样品的 rfu值。
[0257] 图1显示了在37°C下底物转换15分钟后测得的依赖于rFC浓度的rfu值的图。 在描述的实验条件下测定的焚光团（AMC)的特异焚光为6667rfu/nmol。
[0258] 为了计算rFC的比活，采用0.331 y g/ml的rFC浓度。这相当于微量滴定板中每孔 0.0662 1^的迚(：。据此，测得 436(^包八15111111\0.0662 1^冲〇。这相当于 290.67"11/ (minX0.0 662 y g rFC)。这进而相当于 4390735rfu/(minXmg rFC)。这进一步相当于 658nmol/(min X mg rFC)，其进而相当于 0.658 nmol/(min X mg rFC)。
[0259] 根据Ding等.（1993)，一个单位被定义为37°C下每分钟水解的1 y mol的AMC。根 据这个定义及上面的计算，在所描述的分析条件下，重组C因子具有0. 658单位/mg蛋白的 比活。当用胰凝乳蛋白酶激活C因子蛋白时，也得到了一样的比活（数据没有显示）。
[0260] 如从分析设置变得清楚，使用由LPS激活的C因子蛋白测定比活。因此，这个实验 显示了在利什曼虫属中制备的C因子可以被LPS激活，并且所述激活的C因子蛋白为有酶 促活性的，即，呈现出水解活性。
[0261] 实施例5、在非还原和还原条件下在SDS-PAGE上测定C因子蛋白的分子量
[0262] 在利什曼虫属中制备的C因子蛋白的分子量已经在非还原和还原条件 (SDS-PAGE)下测定。将均为50 y 1的还原和非还原rFC样品以及20 y 1的分子量标准品上 样到10泳道的VarioGel (4-12% )上。在垂直凝胶电泳槽中完成电泳后，根据厂商的实验 方案用即时可用的PageBlue?蛋白染色溶液（Fermentas)对胶染色。
[0263] 通过用蛋白条带的迀移距离（单位为cm)除以从胶的前端的总的迀移距离（单位 为cm)计算Rf值。针对标记蛋白的分子量绘制标记蛋白的Rf值的图。用对数拟合算法对 得到的曲线进行拟合。根据产生的标准曲线拟合等式，分别计算在非还原和还原条件下的 纯化的C因子蛋白的分子量。根据所述等式，计算对于C因子的下面的分子量。
[0264] 表2 :在非还原和还原SDS PAGE工作条件下的纯化的C因子的Rf值
[0265]
[0266] 在非还原条件下通过SDS-PAGE测得，所述双链形式的C因子蛋白（rFC ox)具有 102kDa的分子量。在还原条件下，已经测定H链（rFC red 1)具有69kDa的分子量，L链 (rFC red 2)具有37kDa的分子量。
[0267] 还原条件下的H链和L链的分子量（rFC red 1+rFC red 2)合起来为106kDa (包 括糖基化）。
[0268] 序列表
[0269] SEQ ID NO: 1:编码无前导序列的来源于中国豐（Tachypleus tridentatus)的野 生型C因子蛋白的基因的核苷酸序列，长度：2982个核苷酸。
[0271]
[0272] SEQID NO:2:无前导序列的来源于中国量（Tachypleus tridentatus)的野生型 C因子蛋白的氨基酸序列，长度：994个氨基酸残基。
[0273] rgvdlglcdetrfeckcgdpgyvfnvpmkqctyfyrwrpyckpcddleakdicpkykrcqeckagldsc vtcppnkygtwcsgecqcknggicdqrtgactcrdryegahceilkgcpllpsdsqvqevrnppdnpqtidyscspg fklkgvarisclpngqwssfppkcirecakvsspehgkvnapsgnmiegatlrfscdspyyligqetltcqgngqws gqipqckklvfcpdldpvnhaehqvkigveqkygqfpqgtevtytcsgnyflmgfntlkcnpdgswsgsqpscvkva drevdcdskavdfIddvgepvrihcpagcsltagtvwgtaiyhelssvcraaihagklpnsggavhvvnngpysdf1 gsdlngikseelkslarsfrfdyvssstagrsgcpdgwfeveencvyvtskqraweraqgvctnmaarlavldkdli pssltetlrgkgltttwiglhrldaekpfvwelmdrsnvvlndnltfwasgepgnetncvyldirdqlqpvwktksc fqpssfacmmdlsdrnkakcddpgplenghatlhgqsidgfyagssiryscevlhylsgtetvtcttngtwsapkpr cikvitcqnppvpsygsveikppsrtnsisrvgspflrlprlplplaraakpppkprssqpstvdlaskvklpeghy rvgsraiytcesryyellgsqgrrcdsngnwsgrpascipvcgrsdsprspfiwngnsteigqwpwqagisrwladh nmwflqcggsllnekwivtaahcvtysataeiidpsqfkiylgkyyrddsrdddyvqvrealeihvnpnydpgnlnf dialiqlktpvtlttrvqpiclptdittrehlkegtlavvtgwglnenntysemiqqavlpvvaastceegykeadl pltvtenmfcagykkgrydacsgdsggplvfaddsrterrwvlegivswgspsgcgkanqyggftkvnvflswirq fi
[0274] SEQIDNO:3:用于在利什曼虫属中表达的密码子优化过的、无前导序列的来源于 中国鲎（T.tridentatus)的C因子的核苷酸序列，长度：2982个核苷酸。
[0275] aggggtgtggacctgggcctgtgcgacgagacccgcttcgagtgcaagtgcggcgacccgggctacgtg ttcaacgtgccgatgaagcagtgcacgtacttctaccgctggcgcccgtactgcaagccgtgcgacgacctggaggc gaaggacatctgcccgaagtacaagcgctgccaggagtgcaaggcgggcctggacagctgcgtgacgtgcccgccga acaagtacggcacgtggtgcagcggcgagtgccagtgcaagaacggtggcatctgcgatcagcgcacgggcgcgtgc acatgccgcgatcgctacgagggcgcgcactgcgagatcctgaagggctgcccgctgctgccgagcgacagccaggt gcaggaggtgcgcaacccgccggacaacccgcagacgatcgactactcgtgcagccccggcttcaagctcaagggcg tggcgcgcatcagctgcctcccgaacggtcagtggtcgagcttcccgccgaagtgcatccgcgagtgcgcgaaggtg agcagcccggagcacggcaaggtgaacgcgccgagcggcaacatgatcgagggcgcgacgctgcgcttcagetgcga cagcccgtactacctgatcggccaggagaccctgacctgccagggcaacggccagtggagcggccagatcccgcagt gcaagaagctggtcttctgcccggacctggacccggtgaaccacgcggagcaccaggtgaagatcggcgtggagcag aagtacggccagttcccgcagggcacggaggtgacgtacacgtgcagcggcaactacttcctgatgggcttcaacac gctgaagtgcaacccggacggtagctggtcgggcagccagccgtcctgcgtgaaggtggcggaccgcgaggtggact gcgacagcaaggcggtggacttcctggacgacgtgggcgagccggtgcgcatccactgcccggctggctgcagcctg acagcgggcacggtgtggggcacggcgatctaccacgagctgtcgagcgtgtgccgcgctgcgatccacgcgggcaa gctgccgaacagcggcggtgcggtgcacgtggtgaacaacggcccgtacagcgacttcctgggcagcgacctgaacg gcatcaagagcgaggagctgaagagcctggcccgcagcttccgcttcgactacgtgagcagcagcacggctggtcgc agcggctgcccggacggctggttcgaggtggaggagaactgcgtctacgtcacgagcaagcagcgcgcgtgggagcg cgcgcagggcgtgtgcacgaacatggcggctcgcctggccgtgctggacaaggacctgatcccgagcagcctgacgg agaccctgcgcggcaagggcctgacgacgacgtggatcggcctgcaccgcctggacgcggagaagccgttcgtgtgg gagctgatggaccgcagcaacgtggtgctgaacgacaacctgacgttctgggcgagcggcgagccgggcaacgagac caactgcgtgtacctggacatccgcgaccagctgcagccggtgtggaagacgaagagctgcttccagccgagctcct tcgcgtgcatgatggacctgagcgaccgcaacaaggcgaagtgcgacgacccgggtccgctggagaacggccacgcg acgctgcacggccagagcatcgacggcttctacgcgggcagcagcatccgctacagctgcgaggtgctgcactacct gagcggcacggagaccgtgacgtgcacgacgaacggcacgtggtccgcgccgaagccgcgctgcatcaaggtgatca cgtgccagaacccgccggtgccgagctacggcagcgtggagatcaagccgccgtcgcgcacgaactcgattagccgc gtgggctcgccgttcctgcgtctgccacgcctcccactgccgctggctcgtgcggccaagccgccaccgaagccacg cagcagccagccgagcacggtggacctggccagcaaggtgaagctgccggagggccactaccgcgtgggctcgcgcg cgatctacacgtgcgagagccgctactacgagctgctgggcagccagggtcgtcgctgcgacagcaacggcaactgg agcggtcgcccggctagctgcatcccggtgtgcggtcgcagcgactccccgcgctcgccgttcatctggaacggcaa cagcacggagatcggtcagtggccctggcaggcgggcatcagccgctggctggccgaccacaacatgtggttcctcc agtgcggcggcagcctgctgaacgagaagtggattgtgacggcggctcactgcgtgacgtactcggcgacggccgag atcatcgacccgagccagttcaagatctacctgggcaagtactaccgcgacgacagccgcgacgacgactacgtgca ggtgcgcgaggcgctggagatccacgtgaacccgaactacgacccgggcaacctgaacttcgatatcgcgctgatcc agctcaagacgccggtgacgctgacgacgcgcgtgcagccgatctgcctgccgacggacatcacgacgcgcgagcac ctgaaggagggcacgctggccgtcgtgacgggctggggcctgaacgagaacaacacgtacagcgagatgatccagca ggcggtgctgccggtggtggcggcgagcacgtgcgaggagggctacaaggaggcggacctgccgctgacggtgacgg agaacatgttctgcgcgggctacaagaagggccgctacgacgcctgcagcggtgacagcggcggtccgctggtgttc gcggacgacagccgcacggagcgccgctgggtgctggagggcatcgtgagctggggcagcccgagcggttgcggcaa ggcgaaccagtacggcggcttcacgaaggtgaacgtgttcctcagetggatccgccagtttatc
[0276] SEQIDN0:4:由如SEQIDNO:3所示的无前导序列的来源于中国鲎（Tachypleus tridentatus)的C因子蛋白的密码子优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列，长度：994个氨 基酸残基。
[0277] RGVDLGLCDETRFECKCGDPGYVFNVPMKQCTYFYRWRPYCKPCDDLEAKDICPKYKRCQECKAGLDSC VTCPPNKYGTWCSGECQCKNGGICDQRTGACTCRDRYEGAHCEILKGCPLLPSDSQVQEVRNPPDNPQTIDYSCSPG FKLKGVARISCLPNGQWSSFPPKCIRECAKVSSPEHGKVNAPSGNMIEGATLRFSCDSPYYLIGQETLTCQGNGQWS GQIPQCKKLVFCPDLDPVNHAEHQVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLMGFNTLKCNPDGSWSGSQPSCVKVA DREVDCDSKAVDFLDDVGEPVRIHCPAGCSLTAGTVWGTAIYHELSSVCRAAIHAGKLPNSGGAVHWNNGPYSDFL GSDLNGIKSEELKSLARSFRFDYVSSSTAGRSGCPDGWFEVEENCVYVTSKQRAWERAQGVCTNMAARLAVLDKDLI PSSLTETLRGKGLTTTfflGLHRLDAEKPFVWELMDRSNVVLNDNLTFWASGEPGNETNCVYLDIRDQLQPVWKTKSC FQPSSFACMMDLSDRNKAKCDDPGPLENGHATLHGQSIDGFYAGSSIRYSCEVLHYLSGTETVTCTTNGTWSAPKPR CIKVITCQNPPVPSYGSVEIKPPSRTNSISRVGSPFLRLPRLPLPLARAAKPPPKPRSSQPSTVDLASKVKLPEGHY RVGSRAIYTCESRYYELLGSQGRRCDSNGNWSGRPASCIPVCGRSDSPRSPFIWNGNSTEIGQWPWQAGISRWLADH NMWFLQCGGSLLNEKWIVTAAHCVTYSATAEIIDPSQFKIYLGKYYRDDSRDDDYVQVREALEIHVNPNYDPGNLNF DIALIQLKTPVTLTTRVQPICLPTDITTREHLKEGTLAVVTGWGLNENNTYSEMIQQAVLPVVAASTCEEGYKEADL PLTVTENMFCAGYKKGRYDACS⑶SGGPLVFADDSRTERRWVLEGIVSWGSPSGCGKANQYGGFTKVNVFLSWIRQ FI
[0278] SEQIDNO:5:来源于蜥蜴利什曼原虫（Leishmaniatarentolae)的分泌信号肽序 列的氨基酸序列，长度：23个氨基酸残基。
[0279] MASRLVRVLAAAMLVAAAVSVDA
【主权项】
1. 一种寄生原生动物，其特征在于：含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸。2. 根据权利要求1所述的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物 宿主细胞的核酸分子组成，优选所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的载体组 成。3. 根据权利要求1或2所述的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为锥体虫目的成 员。4. 根据权利要求1至3任一项所述的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为利什曼 虫属的成员。5. 根据权利要求1至4任一项所述的寄生原生动物，其中所述寄生原生动物为蜥蜴利 什曼原虫（Leishmania tarentolae) 〇6. 根据权利要求1至5任一项所述的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸编码来 自美洲豐（Limulus polyphemus)、圆尾豐（Carcinoscorpius rotundicauda)、中国豐 (Tachypleus tridentatus)或南方豐（Tachypleus gigas)的 C 因子蛋白。7. 根据权利要求1至6任一项所述的寄生原生动物，其中所述多聚核苷酸编码具有SEQ ID No:4的氨基酸序列的C因子蛋白。8. -种制备鲎C因子蛋白的方法，其包括步骤： (a) 在使得细胞表达由所述多聚核苷酸编码的所述C因子蛋白的条件下培养权利要求 1至7任一项所述的寄生原生动物；和 (b) 从细胞培养物中回收在步骤（a)中制备的C因子蛋白。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中所述C因子蛋白在细胞培养基中积累。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所制备的所述C因子蛋白在结合内毒素时呈 现出丝氨酸蛋白酶活性。11. 由权利要求8的方法获得的鲎C因子蛋白。12. 由权利要求8至10任一项所述的方法制备的鲎C因子蛋白在内毒素检测方法或在 内毒素清除方法中的用途。13. 根据权利要求11的鲎C因子蛋白在内毒素检测方法或在内毒素清除方法中的用 途。14. 一种用于内毒素检测或内毒素清除的分析或试剂盒，其包括由权利要求8至10任 一项所述的方法制备的鲎C因子蛋白，或权利要求11的鲎C因子蛋白。15. -种产生制备鲎C因子蛋白的寄生原生动物宿主细胞的方法，其包括步骤： (a) 将含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的核酸分子，优选为载体，引入到寄生原生 动物，优选为锥体虫目的寄生原生动物，更优选为利什曼虫属的成员，最优选为蜥蜴利什曼 原虫（Leishmania tarentolae);和 (b) 选择一个或多个在步骤（a)中制备的表达所述鲎C因子蛋白的宿主细胞。16. -种由权利要求15的方法获得的寄生原生动物宿主细胞，其含有编码鲎C因子蛋 白的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸由引入至寄生原生动物宿主细胞的核酸分子组成， 优选由载体组成。
【专利摘要】本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地，本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子蛋白的方法，该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。另外，本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。
【IPC分类】C12N9/64
【公开号】CN104884616
【申请号】CN201380068105
【发明人】B·布赫尔格尔, H·格拉莱特, S·莫利纳罗
【申请人】冲压润滑设备生物技术有限责任公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年12月4日
【公告号】CA2893645A1, EP2740791A1, EP2929025A1, US20150299684, WO2014086847A1