一种克伦特罗半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种克伦特罗半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] 克伦特罗（CL)属于苯乙醇胺类β -兴奋剂，临床医学中主要用于扩张支气管和增 加肺通气量，可治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症，在兽医临床中用作 牛、马的产道松弛剂。近年来，克伦特罗作为饲料添加剂，在畜牧业非法使用的情况越来越 严重。
[0003] 多数国家都禁止在动物生产过程中使用克伦特罗。有些国家执行最高残留量 (MRLs)限制，如英国规定的MRLs为0. 5ng/g，荷兰规定的MRLs为lng/g。我国明确规定禁 止CL及其制剂在食品动物的饲养过程中使用。
[0004] 目前检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC-UV)、气-质联机法 (GC-UV)和液-质联机等。这些方法都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有 机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种克伦特罗半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。
[0006] 本发明提供的半抗原，为式（I )所示的化合物；
[0007]
[0008] 式（I )所示的化合物具体可为按如下方法制备得到的化合物：（1)取200mg盐酸 克伦特罗、166mg碳酸钾和15ml DMF，搅拌混匀，然后加入77μ L4-溴丁酸，90°C搅拌3h，自 然冷却至室温，加入50ml蒸馏水，用IM盐酸水溶液调pH至6. 0 ; (2)取步骤（1)得到的溶 液，用乙酸乙酯萃取2次(每次可采用50ml乙酸乙酯)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过 滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为式（I )所示的化合物。
[0009] 本发明还保护式（I )所示的化合物与载体蛋白的偶联物(该偶联物为免疫原或包 被原)。所述载体蛋白具体可为BSA或0VA。
[0010] 本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的试剂盒，包括所述偶联 物。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源多克 隆抗体。
[0011] 本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的化学发光免疫试剂盒， 包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板(偶联物作为包被原)。所述试剂盒还可包括以所 述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源多克隆抗体。
[0012] 所述"包被有所述偶联物的化学发光微孔板"的制备方法具体如下：（1)取所述偶 联物，用包被缓冲液稀释(包被缓冲液具体可为pH9. 6、0. 03M的碳酸盐缓冲液)，得到包被 原稀释液(蛋白浓度具体可为2ng/mL) ; (2)将包被原稀释液加入化学发光微孔板(具体可 100 μ L/孔)，孵育(具体可37°C孵育16小时)，洗涤，拍干；（3)完成步骤（2)后，进行封闭 (每孔可加入200yL封闭液，37°C温育2h ;封闭液的具体配方：将IOg牛血清白蛋白、0.1 mL proclin300和1000 mL pH7. 4、0.0 lM的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液)，倾去孔内的液体， 干燥。
[0013] 本发明还保护以上任一所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦 特罗衍生物中的应用。
[0014] 以上任一所述的克伦特罗衍生物具体可为盐酸克伦特罗。
[0015] 本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推 广应用。
【附图说明】
[0016] 图1为标准曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的。二甲基甲酰胺（DMF) :sigma， 型号：04551。1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺伍0〇:8丨8111 &，型号：165344。 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS) :sigma，型号：56480。盐酸克伦特罗：sigma，型号：54969。
[0018] 克伦特罗的结构式如下：
[0019]
[0020] 实施例1、免疫原和包被原的制备
[0021] 一、半抗原的制备
[0022] 1、取200mg盐酸克伦特罗、166mg碳酸钾和15ml DMF，搅拌混匀，然后加入 77 μ L4-溴丁酸，90°C搅拌3h，自然冷却至室温，加入50ml蒸馏水，用IM盐酸水溶液调pH 至 6. 0。
[0023] 2、取步骤1得到的溶液，用乙酸乙酯萃取2次(每次采用50ml乙酸乙酯)，合并有机 相，用无水硫酸钠干燥，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为半抗原。
[0024] 半抗原的结构式见式（I )。
[0025]
[0026] 二、免疫巾U13·
[0027] 1、取16. 2mg步骤一制备的半抗原，溶于2ml DMF，加入8. 6mg EDC和10. 4mg NHS， 室温搅拌2h。
[0028] 2、取50mg BSA,溶于5ml0.1 M碳酸氢钠水溶液。
[0029] 3、将步骤1得到的溶液逐滴加至步骤2得到的溶液中，室温搅拌10小时，然后装 入透析袋，在PBS缓冲液（pH7. 4、0. 01M)中进行透析（3天，每天换液2次)，得到的溶液即为 免疫原溶液。
[0030] 免疫原的结构式见式（II)。
[0031]
[0032] 三、包被原的制备
[0033] 用OVA代替BSA，其它同步骤二，得到包被原溶液。
[0034] 实施例2、多克隆抗体的制备
[0035] 取实施例1制备的免疫原溶液，采用pH7. 4、0.0 lM的PBS缓冲液稀释，得到免疫原 稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用新西兰大白兔作为免疫动物。
[0036] 免疫过程如下(免疫剂量以蛋白量计）：
[0037] 首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮 下多点注射，免疫剂量为lmg/kg · b. w.;
[0038] 加强免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各进彳了一次加强免疫，将免疫原 稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为Img/ kg · b. w.；
[0039] 末次免疫：首次免疫16周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释 液，免疫剂量为lmg/kg · b.w.。
[0040] 末次免疫1周后,采血并分离血清，即为免疫原对应的多克隆抗体(简称多克隆抗 体甲）。
[0041] 实施例3、化学发光免疫检测试剂盒的组装
[0042] 化学发光免疫检测试剂盒包括如下组件：
[0043] 1、包被了包被原的化学发光微孔板
[0044] 取实施例1制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释(包被缓冲液即pH9. 6、0. 03M 的碳酸盐缓冲液)，得到蛋白浓度为2ng/mL的包被原稀释液。将IOg牛血清白蛋白、0.1 mL proclin300和1000 mL pH7. 4、0.0 lM的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。
[0045] (1)将包被原稀释液加入化学发光微孔板（100 μ L/孔)，37°C孵育16小时。
[0046] (2 )完成步骤（I)后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。
[0047] (3)完成步骤（2)后，每孔加入200 μ L封闭液，37°C温育2h。
[0048] ( 4)完成步骤（3 )后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0049] 2、多克隆抗体工作液
[0050] 取IOmg牛血清白蛋白，用ρΗ7· 4、0· 02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000 mL,得到 抗体稀释液。
[0051] 将实施例2制备的多克隆抗体甲用抗体稀释液稀释至150000倍体积，得到一抗工 作液甲。
[0052] 3、二抗工作液
[0053] 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.产品目录号为115-035-003。
[0054] 将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗用步骤2中的抗体稀释液稀释至1000倍体 积，得到二抗工作液。
[0055] 4、标准品溶液
[0056] 将盐酸克伦特罗溶于ρΗ7· 4、0· 05M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0· 02ng/mL、 0· 06ng/mL、0. 18ng/mL、0. 54ng/mL 和 I. 62ng/mL 的标准品溶液。将 ρΗ7· 4、0· 05M 的磷酸盐 缓冲液作为标准品溶液的阴性对照溶液，称为〇溶液。
[0057] 5、发光底物液
[0058] 发光液由A液和B液组成，A液和B液各一瓶，4mL/瓶。
[0059] A液的制备方法：取0. 2g鲁米诺单钠盐、0.1 g对碘苯酚、0. 16g氯化钠和 0· 18gEDTA-Na2，用 ρΗ8· 4、0· IM 的 Tris-HCl 缓冲液溶解并定容至 1000mL。
[0060] B 液：含 0· 3mM H202、5mM EDTA-Na2 的 ρΗ8· 4、0· IM 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0061] 6、20 X浓缩洗涤液
[0062] 将1000 mL ρΗ7· 4、0· 2Μ的磷酸盐缓冲液与ImL proclin300混合，得到20Χ浓缩 洗涤液。
[0063] 实施例4、实施例3制备的化学发光