免疫检测试剂盒的使用方法
[0064] 向包被了包被原的化学发光微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液（50μ L/ 孔)，再加入一抗工作液甲（50 μ L/孔)和二抗工作液（50 μ L/孔)，室温反应20min，弃上清， 洗涤四次(每次洗涤过程均如下：每孔中加入250 μ L洗涤液，30秒后弃上清；将20X浓缩 洗涤液用水稀释至20倍体积，即为洗涤液)，用吸水纸拍干，每孔加入100 μ L新鲜配制发光 底物液(Α液和B液等体积混合)，用化学发光仪(深圳天众达）检测每孔的光子数。设置五 个复孔。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值（B)除以0溶液的发光强度的平均值 (Β。)，再乘以100%，即结合率。计算公式：结合率（W)=Bz^ lX 100%。以标准品溶液中的盐酸 克伦特罗浓度（ng/mL)为X轴，BziBciSY轴，绘制标准曲线图(见图1)。根据标准曲线的回 归方程可以求出待测样本溶液中克伦特罗或克伦特罗衍生物的浓度。本发明中检测结果的 分析可以利用专业软件，可以实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需30分钟就可以 完成。结合率（Bz iBtl)为50%时对应的标准品溶液中的盐酸克伦特罗浓度即为IC5tl值。根据 标准曲线图，IC 5tl=O. 14ng/mL。
[0065] 试剂盒的检测原理：当在化学发光微孔板上预包被半抗原与载体蛋白的偶联物 时，加入待测样本溶液，随后加入一抗和酶标二抗，待测样本溶液中残留的克伦特罗或克伦 特罗衍生物与化学发光板上包被的包被原竞争一抗，然后与酶标二抗的进一步结合，加入 化学发光底物液，发光强度与待测样本溶液中克伦特罗或克伦特罗衍生物的含量成负相 关，与标准曲线比较即可得出待测样本溶液中克伦特罗或克伦特罗衍生物的残留量。
[0066] 对比例、免疫原对照物和包被原对照物的制备
[0067] 一、制备免疫原对照物
[0068] 1、取IOmg盐酸克伦特罗，溶于ImlO. 2mol/L HCl水溶液，置于冰浴中并加入IOmg 亚硝酸钠，然后室温搅拌30min。
[0069] 2、取50mg BSA，溶于5mllmol/L碳酸钠水溶液。
[0070] 3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析 袋，在生理盐水中进行透析（3天，每天换液2次)，然后用0. 22 μ m孔径的滤膜进行过滤并 收集滤液，即为免疫原对照物溶液。
[0071] 二、制备包被原对照物
[0072] 1、取6mg盐酸克伦特罗，溶于ImlO. 2mol/L HCl水溶液，在于冰浴中并加入6mg亚 硝酸钠，室温搅拌30min。
[0073] 2、取30mg OVA,溶于5mllmol/L碳酸钠水溶液。
[0074] 3、将步骤1得到的溶液逐滴加入步骤2得到的溶液中，室温搅拌5h，然后装入透析 袋，在生理盐水中进行透析（3天，每天换液2次)，然后用0. 22 μ m孔径的滤膜进行过滤并 收集滤液，即为包被原对照物溶液。
[0075] 三、多克隆抗体乙的制备
[0076] 用免疫原对照物溶液代替免疫原溶液进行实施例2,得到免疫原对照物对应的多 克隆抗体(简称多克隆抗体乙)。
[0077] 四、应用包被原对照物和多克隆抗体乙检测盐酸克伦特罗
[0078] 用包被原对照物溶液代替包被原溶液进行实施例3的步骤1，得到对照微孔板。
[0079] 用多克隆抗体乙代替多克隆抗体甲进行实施例3的步骤2,得到一抗工作液乙。
[0080] 用对照微孔板代替"包被了包被原的化学发光微孔板"，用一抗工作液乙代替"一 抗工作液甲"，其它同实施例4, IC5tl值=0. 24ng/mL。
[0081] 实施例5、实施例3制备的化学发光免疫检测试剂盒的特异性
[0082] 分别检测8种待测药物(与克伦特罗结构或功能类似物的9种药物)与克伦特罗的 交叉反应率。
[0083] 1、将待测药物溶于pH7. 4、0. 05M的磷酸盐缓冲液，得到不同浓度的溶液。
[0084] 2、向包被了包被原的化学发光微孔板中加入步骤1制备的溶液（50 μ L/孔)，再加 入一抗工作液甲（50 μ L/孔)和二抗工作液（50 μ L/孔)，室温反应20min，弃上清，洗涤四次 (每次洗涤过程均如下：每孔中加入250 μ L洗涤液，30秒后弃上清；将20 X浓缩洗涤液用 水稀释至20倍体积，即为洗涤液)，用吸水纸拍干，每孔加入100 μ L新鲜配制发光底物液(Α 液和B液等体积混合)，用化学发光仪检测每孔的光子数。
[0085] 交叉反应率（％)=(盐酸克伦特罗的IC5tl值/待测药物的IC5tl值）X 100%。结果见 表1。试剂盒的特异性良好。
[0086] 表1交叉反应率结果
[0087]
[0088] 头她例(3、头她例3制奋的诼刑显的1'王酣
[0089] 一、样本前处理的方法(制备空白样本）
[0090] 猪尿：取不含克伦特罗和盐酸克伦特罗的尿样，3000g离心5min，取50 μ L上清液 用于分析。
[0091] 猪肉：取2g不含克伦特罗和盐酸克伦特罗的猪肉，均浆后，加入IOmLO. 4Μ高氯酸 水溶液，震荡混合l〇min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液用IM NaOH溶液调pH值 至11，加入2mL乙酸乙酯-异丙醇（8体积乙酸乙酯与2体积异丙醇混匀)，3000g离心5min, 取上层有机相，用氮气吹干，然后加入2mL pH7. 4、0.0 lM的PBS缓冲液溶解残留物。
[0092] 二、试剂盒保存期实验
[0093] 试剂盒保存条件为2-8°C，保存6个月后，测定盐酸克伦特罗的IC5tl值，零孔光子 数。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存条件下放置 6天，进行热加速实验。结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。
[0094] 表2低温保存实验结果
[0095]
[0096] 表3热加速实验
[0097]
[0098] 三、试剂盒的灵敏度、精密度、准确度
[0099] 1、灵敏度
[0100] 以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样本，按实施例3的 使用方法进行检测，检测信号值，计算空白样本光子数（RLU)的平均值，并将此平均值带入 标准曲线得到对应的待测物浓度，计算各对应浓度值的标准差（SD)，由平均值加三倍标准 差即为该样本的最低检测限（LOD)，结果见表4。
[0101] 表4克伦特罗在猪尿和猪肉中的最低检测限
[0102]
[0103] 2、精密度
[0104] 从三批试剂盒（01批、02批、03批)中每批抽取五个试剂盒，测定0. 2ng/ml、0. 5ng/ ml两个浓度（即在猪尿空白样本中加入盐酸克伦特罗)，每个浓度设置5个平行，重复5次， 根据标准曲线，算出各个RLU对应的浓度值，并计算板内板间变异系数，结果见表5,批内批 间变异都< 15%，说明试剂盒的精密性良好。
[0105] 表5试剂盒的精密度
[0106]
[0107]
[0108] 3、准确度
[0109] 试剂盒的添加实验反映其准确度。在猪尿空白样本中加入盐酸克伦特罗，使其浓 度为0. 2ng/ml或0. 5ng/ml。猪肉空白样本中加入盐酸克伦特罗，使其浓度为0. 3ng/ml或 0.5ng/ml。每个浓度5个平行。样本处理后，测定克伦特罗的浓度，同时考虑稀释倍数，代 入标准曲线计算回收率，同时计算变异系数(三个批次的试剂盒)。结果见表6和表7。
[0110] 表6猪尿中克伦特罗添加回收率与变异系数
[0111]
[0112] 表7猪肉中克伦特罗添加回收率与变异系数
[0113]
【主权项】
1. 式（I)所示的化合物；2. 式（I)所示的化合物与载体蛋白的偶联物。3. 如权利要求2所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为BSA或OVA。4. 一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的试剂盒，包括权利要求2或3所述偶联 物。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以权利要求2或3所 述偶联物为免疫原得到的抗体。6. -种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的化学发光免疫试剂盒，包括包被有权利 要求2或3所述偶联物的化学发光微孔板。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以权利要求2或3所 述偶联物为免疫原得到的抗体。8. 权利要求6或7所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦特罗衍生物 中的应用。9. 权利要求4或5所述试剂盒在检测待测样本中是否含有克伦特罗或克伦特罗衍生物 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种克伦特罗半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明提供的半抗原，为式（Ⅰ）所示的化合物。本发明还保护式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物（该偶联物为免疫原或包被原）。本发明还保护一种用于检测克伦特罗或克伦特罗衍生物的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。
【IPC分类】C07K14/765, C07K14/77, G01N33/531, C07C229/18, C07C227/08
【公开号】CN104892442
【申请号】CN201410082848
【发明人】吴小平, 江海洋, 王文珺, 王世恩, 王战辉, 许舒婷, 陈银辉, 邢佑尚, 王照鹏
【申请人】北京维德维康生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月7日