表面带正电荷具有聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其生物应用
【技术领域】
[0001]本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种表面带正电荷具有聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球及其在细胞成像和生物检测等方面的应用。
【背景技术】
[0002]生物成像是一个集合多种技术、交融多种学科、应用广泛、发展迅速的新兴领域。近些年来随着生物化学和生命科学的发展，人们对生物体的研宄逐渐从宏观转向了微观。因此其分支领域之一的生物荧光成像成为人们研宄和关注的焦点。荧光技术具有快捷、灵敏、实时、无放射性、重复性好，多个光物理参量(如发射波长、激发波长、荧光强度、荧光寿命)可用于检测等优点。荧光探针是实现生物荧光成像的核心技术。传统的荧光探针以有机荧光染料为主，但由于有机荧光染料耐光性差、水溶性差、生物相容性差以及聚集荧光诱导淬灭等缺点，而难以在实际中应用。随着生物荧光成像应用的日益广泛，研发出新型的荧光探针以克服传统探针的缺点变得刻不容缓。因此，荧光纳米粒子探针作为解决这一问题的有效手段被提出。
[0003]目前焚光纳米粒子探针主要包括:量子点(quantum dot, QD)，上转换稀土纳米粒子(Upconvers1n Rare Earth Nanoparticles, UCRE-NPs)和高分子焚光纳米微球。无机量子点由于荧光效率高被人们广泛用于生物标记等领域，但是研宄发现当无机量子点用于生物成像进入生物体内时，表面易被体内的氧化剂氧化成重金属离子，因此生物毒性大不宜于生物成像。高分子荧光纳米微球开始是以聚苯乙烯、聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酸酯类为微粒主体，表面键合或吸附荧光物质的荧光纳米微球。因为单个纳米粒子可以键合多个荧光分子，所以荧光强度有所增强。与小分子的有机染料相比，高分子荧光纳米微球通常在水相中分散性良好、荧光发射强度较强、发光效率较高的同时，光漂白的现象发生几率很低；并且在多种生物环境之下粒子稳定性和生物相容性都很高。所以很多高分子荧光纳米微粒无需经过繁琐的改性及改良就可以直接用于生物成像荧光探针、荧光生物传感器等生物应用领域。但目前用于高分子荧光纳米微球的大部分荧光分子具有聚集诱导淬灭性质。在制备高效率高分子荧光纳米微球时荧光染料加入量少时荧光信号不能显著地提高，但加入量大时由于聚集诱导淬灭效应荧光信号也会衰减或没有荧光发射，使其应用受到限制。
[0004]近年来，具有聚集诱导发光(AIE)的荧光分子受到人们的关注。它与传统的荧光分子不同，AIE分子在聚集态或不良溶剂中荧光会显著增强，当处于自由状态时由于分子内转动加剧消耗吸收的能量使荧光衰减。但AIE分子多为有机染料小分子，生物相容性差，在血液中循环时间短不能有效的进入细胞因此不能用于生物成像。因此设计一个有效载体能实现荧光分子的AIE效应并且生物相容性好，生物毒性低，尺寸合适，细胞穿透性好以及体内环境对其荧光没有淬灭作用，在生物成像领域是至关重要的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可用于细胞成像和生物检测的表面带正电荷的具有聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球。
[0006]本发明首先合成出一种表面带正电荷的纳米微球乳液，将带有负电荷的具有AIE效应的荧光分子通过静电作用力修饰到纳米微球表面。荧光分子由于受到库仑力的作用分子内转动受到限制，吸收的能量基本通过荧光辐射释放出来，因此荧光分子修饰到纳米微球上其荧光强度增强百倍，表现出优异的AIE性质。我们所制得的荧光纳米微球荧光性质稳定，生物相容性好，毒性低，表面带正电荷易于进入细胞内部，进行细胞荧光成像和生物检测。因此，我们制得的表面带正电荷的荧光纳米微球在细胞成像等生物领域具有广阔的应用前景。
[0007]本发明所述的表面带正电荷的具有聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球，其由如下步骤制备得到:
[0008](I)量取5?1mL聚合单体I分散于150?200mL的去离子水中，再加入0.04g?0.5g的聚合单体2 ;室温、氮气保护下，机械搅拌(300?600rpm)，除去反应体系中的氧气；升温至70?90°C后加入1mL含0.3?0.5mmol引发剂的水溶液于反应体系中，氮气保护、搅拌下聚合反应5?20小时，得到表面带正电荷的纳米微球溶液；高速离心(15000?20000rpm)洗涤除去未反应的单体、低聚物、引发剂等杂质，纳米微球重新超声分散于10mL去离子水中；
[0009](2)量取10?20mL步骤⑴所得到的纳米微球溶液，加入10?20mL去离子水，然后再加入3?5mL、80?150 μ g/mL的AIE型荧光分子，在50?80°C、氮气保护条件下，磁力搅拌反应4?1h ;高速离心(15000?20000rpm)除去未复合的AIE型荧光分子，获得AIE分子复合的表面带正电荷的荧光纳米微球；将得到的荧光纳米微球分散于去离子水中，从而得到本发明所述的表面带正电荷的具有聚集诱导荧光增强性质的荧光纳米微球。
[0010]上述方法中，聚合单体I是苯乙烯(St)、氟代苯乙烯(F-St)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、氯乙烯、丙烯酸叔丁酯、二乙烯基苯或α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA);
[0011]上述方法中，聚合单体2是N，N，N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)，2- ( 二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)或2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(AMA);
[0012]上述方法中，引发剂是偶氮二异丁脒盐酸盐(V5tl),偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(AIBI)，偶氮异丁氰基甲酰胺(V3tl);
[0013]上述方法中，AIE型的荧光分子是9，10- 二(苯乙烯基)蒽磺酸盐(DSA)、1，2- 二[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯二钠盐(BSTPE)或1，1，2，2-四[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]乙烯四钠盐(TSTPE)。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015]1、该荧光纳米微球的粒径在纳米级别且尺寸可控(50?140nm)；
[0016]2、该荧光纳米微球生物相容性好，在磷酸缓冲溶液和生物大分子溶液中能稳定存在3个月以上(图5);
[0017]3、该荧光分子在pH = 3?7范围内荧光基本稳定，在pH = 7?10范围内荧光呈线性降低，但降低程度对荧光成像没有影响；
[0018]4、该荧光纳米微球表面带正电荷，易于进入细胞，进行细胞荧光成像和生物检测。
[0019]5、该焚光纳米微球在生物大分子如BSA存在时焚光信号增强，生物大分子可以起到放大荧光信号的作用。并且BSA浓度和荧光强度呈线性变化，因此此材料可用于检测BSA浓度(图7)。
[0020]6、该荧光纳米微球的细胞毒性低(图8)，利于其进行生物应用。
【附图说明】
[0021]图1:为实施例1制备的纳米微球扫描电子显微镜照片(SEM)；
[0022]图2:为实施例1制备的纳米微球和荧光纳米微球动态光散射粒径图；
[0023]图3:为实施例1制备的纳米微球和荧光纳米微球动态光散射Zeta图；
[0024]图4:为实施例1制备的荧光纳米微球和荧光分子水溶液荧光谱图(荧光分子浓度相同，入ex = 420nm)；
[0025]图5:为实施例1制备的荧光纳米微球水溶液、荧光纳米微球胎牛血清(FBS)磷酸缓冲溶液(pH = 7.4)、3个月后的荧光纳米微球胎牛血清(FBS)磷酸缓冲溶液(pH = 7.4)的动态光散射粒径图；
[0026]图6: (I)为实施例1制备的荧光纳米微球在不同PH磷酸缓冲溶液下，荧光纳米微球的荧光谱图；(2)为实施例1制备的荧光纳米微球荧光强度与pH关系图；
[0027]图7: (I)为实施例1制备的纳米微球在不同BSA浓度下荧光谱图；⑵为BSA浓度与荧光强度曲线图；
[0028]图8: (I)为实施例1荧光纳米微球对人胃粘膜上皮细胞(GES-1)的细胞毒性测试图；(2)为实施例1荧光纳米微球对人胃癌细胞(SGC-7901)的细胞毒性测试图；
[0029]图9: (a)为实施例1制备的纳米微球在正常细胞人胃粘膜上皮细胞(GES-1)荧光共聚焦明场照片；(b)为实施例1制备的纳米微球在正常细胞人胃粘膜上皮细胞(GES-1)荧光共聚焦明场和暗场叠加照片；(c)为实施例1制备的纳米微球在正常细胞人胃粘膜上皮细胞(GES-1)荧光共聚焦暗场照片；(d)为实施例1制备的纳米微球在正常细胞人胃癌细胞(SGC-7901)荧光共聚焦明场照片；(e)为实施例1制备的纳米微球在人胃癌细胞(SGC-7901)荧光共聚焦明场和暗场叠加照片；(f)为实施例1制备的纳米微球在人胃癌细胞(SGC-7901)荧光共聚焦暗场照片；
[0030]图10:为实施例2制备的纳米微球扫描电子显微镜照片(SEM)；
[0031]图11:为实施例3制备的纳米微球扫描电子显微镜照片(SEM)；
[0032]图12:为实施例4制备的纳米微球扫描电子显微镜照片(SEM)。
【具体实施方式】
[0033]实施例1:
[0034](I)取5mL苯乙烯(分析纯，经减压蒸馏除阻聚剂)和0.06g N, N, N-三甲基乙烯基苯甲氯化铵(VBTAC)加入到含有185mL去离子水的500mL的三颈瓶中，室温、氮气保护下机械搅拌(400rpm)30分钟，除去反应体系中的氧气，然后升温到70°C，加入10mL、含有0.37mmol偶氮二异丁脒盐酸盐(V5tl)引发剂的水溶液引发聚合，聚合在氮气保护、400rpm的搅拌速度下进行10h。聚合得到的纳米微球在18500rpm的转速下离心3次，并用去离子水洗涤3次，除掉未反应的单体、低聚物、引发剂等，重新分散到10mL去离子水中，便制得质量浓度为2.92%表面带正电荷的纳米微球溶液。
[0035](2)取1mL纳米微球溶液加入1mL去离子水再加入3mL、100 μ g/mL DSA于三颈瓶中，放入搅拌子，在磁搅拌下加热到50°C反应4h，