左右就可以出现致密的克隆，而 在21%02条件下则无致密克隆生成（图1A)。20万个起始细胞可以出现大约40个致密的克 隆。中间态克隆的诱导效率在5%0 2条件下相对于3%02条件略高，因此，在后续的诱导实验 中采取5%02的培养条件。
[0142] 1. 2对I. 1中的细胞克隆进行AP染色
[0143] 对这些中间态克隆进行碱性磷酸酶AP染色发现，约有3/4的致密克隆高表达碱性 磷酸酶AP (图1B、图3A)，而在正常氧压条件下VPCR处理的小鼠成纤维细胞中既未发现致 密克隆也未发现AP阳性的细胞。
[0144] L 3对L 1中的VPCR的组分进行进一步筛选
[0145] 检查VPA、CHIR99021、R印sox和Parnate都是诱导获得致密克隆的必要成分。为 此,采用VPCR中的任三种化合物的组合处理小鼠成纤维细胞，检查能否获得致密的克隆形 成。
[0146] 结果如图2所示，Parnate对于致密克隆的形成是可有可无的，而另外三个化合物 则是必需的成分，不用这三个化合物中的任一个则大大地减少诱导形成的致密克隆的数目 (图2A)。在5%0 2条件下用VCR (VCR、CHIR99021和R印sox)处理获得的致密克隆中有90% 是AP阳性的。进一步实验表明，再添加一些促重编程化合物 31^到VCR组合中也无进一步 的提升效果（图2B)。
[0147] 结论：VCR化合物组合中的任一组分（即VPA、CHIR99021、Itepsox)对体细胞在正 常生理低氧条件下转分化为神经干细胞是必须的。
[0148] 实施例2VCR处理细胞克隆的特性检测
[0149] 2. 1Sox2在不同氧压下的表达
[0150] 在正常氧压条件下或用其它缺失R印sox、CHIR99021或者VPA的化合物组合则不 能有效的诱导Sox2表达（图2C和2D)
[0151] 2. 2不同神经干细胞相关基因在细胞克隆中的表达
[0152] 如图3B所示，在正常生理低氧条件下用VCR处理小鼠成纤维细胞，发现Sox2的表 达在第5天明显提高，在第10天达到顶峰，在第15天略有回落；而0ct4和Nanog的表达 则只是在第10天略有提商表达。
[0153] 结论：小分子化合物组合VCR在5%02正常生理低氧条件下有利于小鼠胚胎成纤维 细胞转分化到中间态的致密克隆。
[0154] 实施例3VCR处理细胞克隆的神经干细胞分化
[0155] 3. 1培养克隆的形态观察
[0156] 在正常生理低氧条件下，将VCR组合处理10天左右的细胞进行消化重新铺种并在 含肝素 heparin，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的神经干细胞培养基条 件下培养，大约7-10天后，培养的细胞中出现神经干细胞状的双极性形态（图3C)。
[0157] 3. 2神经干细胞特异性基因检测
[0158] 神经干细胞标记基因 Nestin、Sox2和Pax6可以用免疫荧光染色方法检测到（图 4A)。进一步地,逆转录聚合酶链式反应检测到神经干细胞特异基因包括Sox2、Pax6、Blbp、 Ascll和Brn2的表达水平也是增强的（图3D，ciNPCpl)。
[0159] 结论：神经干细胞状的细胞出现在培养体系中。当这些细胞悬浮培养时形成了 漂浮的细胞簇，细胞簇免疫荧光染色显示是Sox2和Nestin阳性的，具有神经球的性质（图 4A)。收集这些漂浮的细胞簇并把它们命名为化合物诱导的神经干细胞/神经球（ciNPC)代 数 I (pi)。
[0160] 实施例4化合物诱导的神经干细胞（ciNPC)的增殖和自我更新特性鉴定
[0161] 4. 1悬浮培养神经球细胞并测定其是否具有神经干细胞的基本性质（增殖和自我 更新）
[0162] 培养4代（p5)后，大约50%的化合物诱导的神经干细胞免疫荧光染色是Sox2阳 性的，60%多的细胞室Pax6阳性的，大约40%的细胞是Nestin阳性的，而有30%的细胞是 Nestin/Pax6 或者 Nestin/Sox2 双阳性的（图 4B)。
[0163] 13代（pl3)的化合物诱导的神经干细胞贴壁单层培养时展示了类似于小鼠胚胎 神经干细胞的双极形态（图3C，ciNPC p5)。定量链式聚合酶酶反应检测不同代数的化合物 诱导的神经干细胞中Sox2、Pax6、Blbp、Ascll和Brn2的表达水平，发现悬浮培养可以很好 地富集原始诱导的混合细胞中的神经干细胞（图3D，ciNPC pl3)。
[0164] 在细胞代数13代时，超过96%的化合物诱导的神经干细胞呈Nestin、Sox2或Pax6 单阳性，大约有93%的化合物诱导的神经干细胞呈Nestin/Sox2或Nestin/Pax6双阳性（图 3E，图5)，提示已经形成较纯的神经干细胞群体（图3F)。并且不仅仅这些13代的化合物 诱导的神经干细胞呈增殖标记物Ki67阳性（图6A)，而且当这些神经球在低密度铺种时展 示出类似于小鼠脑袋衍生的神经干细胞第5代的大小和数量（图6B)。其中，Nestin、Sox2 或Pax6单阳性代表具有类似神经干细胞的细胞的生成；Nestin/Sox2或Nestin/Pax6双阳 性代表神经干细胞的生成。
[0165] 以上结果表明，这些化合物诱导的神经干细胞具有小鼠脑袋衍生的神经干细胞类 似的增殖和自我更新能力。
[0166] 4. 2神经球形成能力的传代稳定性测定
[0167] 对这些化合物诱导的神经干细胞的增殖能力进行进一步的检测，发现这类神经干 细胞的神经干细胞标记基因表达水平和悬浮培养时的神经球形成能力直至25代仍没有改 变（图6C和6D)。
[0168] 结论：在正常生理低氧条件下VCR处理小鼠胚胎成纤维细胞可以获得较纯的可以 扩增的神经干细胞。
[0169] 实施例5化合物诱导的神经干细胞的转录谱研究
[0170] 采用小鼠胚胎衍生的神经干细胞(对照NPCs)、小鼠胚胎成纤维细胞和第5代及13 代的化合物诱导的神经干细胞抽提mRNA并运用芯片对这些细胞进行全基因组表达类型分 析。
[0171] 5. 1化合物诱导的神经干细胞与小鼠神经干细胞的相似性
[0172] 全基因组聚类和热图分析（图7A)和散点图分析（图8B)揭示化合物诱导的神经干 细胞和小鼠胚胎成纤维细胞具有很大的不同，但是化合物诱导的神经干细胞和小鼠脑袋衍 生的神经干细胞具有很大的相似性。不同代数的化合物诱导的神经干细胞和对照的神经干 细胞共有774个核心靶基因（图7C)，通过基因本体分析（G0分析）发现这些基因主要与神 经发生和细胞形态等过程相关（图7D和图8A)。
[0173] 神经干细胞特异基因比如 Sox2、Pax6、Ncan、Tox3,、Hes5、Gpm6a、Nes,、Bmil、 Zbtbl6、Rfx4、Gpm6a和Slcla3在化合物诱导的神经干细胞中表达明显上调，并具有和小鼠 胚胎神经干细胞相当的表达水平；然而多能性相关基因 P〇f5fl和Nanog的表达并未上调， 说明诱导获得的神经干细胞并不具有多能干细胞的特性。（图8B)。
[0174] 5. 2化合物诱导的神经干细胞与小鼠成纤维细胞的区别
[0175] 生物学过程比如骨架系统的表达谱是化合物诱导的神经干细胞相对于小鼠成纤 维细胞最明显下调表达的基因（图8C和8D)。其中，424个基因比如Col3al、DKK3、ThyU Snaill和其它成纤维特异的基因的表达水平从第5代至第13代逐渐下调。这些发现表明 化合物诱导的神经干细胞保存部分的成纤维细胞的表观遗传记忆，可以排除起始的小鼠胚 胎成纤维细胞中可能的神经干细胞污染。另一方面，小鼠成纤维细胞直接在DMEM或神经干 细胞培养基中培养并没有检测到Nestin、Sox2或者Pax6的表达（图9)。
[0176] 5. 3芯片数据中不同脑区特异的基因表达（图8E)
[0177] 化合物诱导的神经干细胞和小鼠脑袋衍生的神经干细胞都具有较高的腹侧脑区 特异的基因如01ig〇2和Nkx2. 2的表达水平，而没有检测到背侧脑区特异的基因如Pax3和 Pax7的表达。
[0178] 同时，实验还发现前脑特异基因 Emx2、Foxgl和Nr2el以及中脑特异基因 Gbx2和 Enl的高表达，但是，并没有后脑特异基因如Hoxa7和Hoxb7的高表达。
[0179] 综上，本发明所获得的化合物诱导的神经干细胞具有腹侧的前中脑区的特性，但 不是很好地具有其它脑区的性质。
[0180] 5. 4芯片中ciNPCs和NPCs的组蛋白去乙酰化酶（HDACs)、糖原合成酶激酶3 β (GSK-3)、转化生长因子β (TGF-β)和正常生理低氧信号传导通路的表达类型研究
[0181] 化合物诱导的神经干细胞和对照神经干细胞中在这些信号传导通路具有相似的 表达类型，并有小鼠胚胎成纤维细胞具有很大的区别（图10)。
[0182] 这些数据揭示激活这几条信号传导通路对于成功的转分化小鼠胚胎成纤维细胞 到神经干细胞是必需的。
[0183] 结论：从基因表达谱来看，本发明化合物诱导的神经干细胞与小鼠神经干细胞 具有很大的相似性，但与小鼠成纤维细胞则区别很大。此外，本发明化合物诱导的神经干 细胞还具有腹侧的前中脑区的特征，且组蛋白去乙酰化酶（HDACs)、糖原合成酶激酶3 β (GSK-3)、转化生长因子β (TGF-β)和正常生理低氧信号的传导通路在体细胞转化为神经 干细胞的过程中是必须的。
[0184] 实施例6化合物诱导的神经干细胞的多能性鉴定
[0185] 6. 1体外分化实验检测化合物诱导的神经干细胞的分化能力
[0186] 6. 11实验发现，第5代或13代的化合物诱导的神经干细胞在添加了 ΒΜΡ4和1%FBS 并且撤掉生长因子的N2B27培养基中培养7天后，约有90%的细胞具有星形胶质细胞的形 态并且免疫荧光染色是GFAP阳性的。
[0187] 而在添加了 B27、N2、BDNF、⑶NF、IGF、cAMP和Ascorbic acid的神经基础培养基 中培养7天则有80%的细胞具有神经元的形态且是Tujl阳性的，在培养10-14天后则是具 有成熟神经元的形态和Map2/Tujl双阳性的（图IlA和图12A)。Map2或Tujl在GFAP阳性 的细胞中不表达，这代表分化的细胞具有功能特异性。
[0188] 当采用更细致的诱导分化条件时发现第13代的化合物诱导的神经干细胞在含 bFGF，TOGF-AA和T3的培养基中培养12天后，可以观察到01ig2/Mbp双阳性的细胞并且具 有少突胶质细胞的形态（图12A，分化效率为25%左右）。进一步地，分化四周后可以发现成 熟神经元如NeuN、Synapsin和GAD67的表达（图IlB和图12B)。
[0189] 6. 12进而用全细胞膜片钳实验检测化合物诱导的神经干细胞的成熟度和功能
[0190] 实验发现，化合物诱导的神经干细胞分化的神经元可以产生重复记录的动作电位 (图12C)和自发突触后电流（图12D)。此外，Na +电流也可以在这些分化得到的神经元中记 录到（图12E)。<