相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始72h后加入培养基。
[0041]处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比7%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为390-400U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0042]实施例5
[0043]与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是:以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基(g/L):木薯淀粉60，硫酸铵10，NaN036，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾I ;萃取相(占基本培养基的体积t匕):大豆油10%，玉米油10%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。
[0044]处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为400-410U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0045]实施例6
[0046]与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是:以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基(g/L):木薯淀粉60，硫酸铵10，NaN036，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾I ;萃取相(占基本培养基的体积t匕):大豆油5%，玉米油5%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。
[0047]处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为320-330U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0048]实施例7
[0049]与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是:以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基(g/L):木薯淀粉60，硫酸铵10，NaN036，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾I ;萃取相(占基本培养基的体积t匕):大豆油10%，玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。
[0050]处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为410-420U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0051]实施例8
[0052]与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是:以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基(g/L):木薯淀粉70，硫酸铵8，NaN036，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁1，磷酸二氢钾I ;萃取相(占基本培养基的体积t匕):大豆油10%、玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。
[0053]处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为450-460U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0054]实施例9
[0055]以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制:基本培养基(g/L):木薯淀粉70，硫酸铵8，NaN036，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁I，磷酸二氢钾I ;萃取相(占基本培养基的体积比):大豆油20%。处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30°C条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为390-400U/mL (折合到基本培养基体积)。
[0056]实施例10普通发酵方式产红曲橙色素
[0057]红曲橙色素液态发酵过程:PDA斜面一制成孢子悬浮液一接种至种子液一培养48h，接入发酵培养基，接种量为5% —培养5天后，发酵液预处理，测色价。
[0058]斜面培养基(PDA培养基):马铃薯200g加水煮沸30min，葡萄糖20g，琼脂15?20g，定容 100mL,自然 pH。
[0059]种子培养基(g/L):玉米淀粉40，硫酸铵 4，KH2PO4, 2.0 ;Κ2ΗΡ04，2.0 ；MgS04.7H20，0.5 ；CaCl2,0.1 ；FeS04.7Η20，0.01 ；ZnSO4.7Η20，0.01 ；MnSO4.H2O, 0.03 ；NaN03,2.0 ；ρΗ5.0。
[0060]液态摇瓶发酵培养基(g/L):玉米淀粉，60.0 ;硫酸铵，4.0 ;ΚΗ2Ρ04，2.0 ;K2HP04，
2.0 ；MgS04.7Η20，0.5 ；CaCl2,0.1 ；FeS04.7Η20，0.01 ；ZnSO4.7Η20，0.01 ；MnSO4.H2O, 0.03 ；NaNO3, 2.0 ;起始pH值为5.0 ;发酵时间为4.0d。
[0061]孢子悬浮液的制备:取斜面菌种一只，加入适量无菌水和少量玻璃珠，充分振荡后用无菌滤纸过滤，再以血球计数板计数，使孢子浓度达到16个/mL。
[0062]红曲菌种子培养:250mL三角瓶装液量45mL，接种量:孢子悬浮液2mL。30°C往复式摇床，行程10cm，100r/min振荡培养48h。
[0063]红曲菌摇瓶液态培养:装液量10mL (500mL三角瓶)，接种量5%。30°C，往复式摇床100r/min，培养时间4天左右。摇瓶发酵液色价值:79.53U/mL。
[0064]由上述实施例可知，在偶联原位萃取发酵红曲橙色素的双液相发酵方法中，培养基各成分的比例对红曲菌发酵产橙色素有较大的影响。在培养基配比方面，较高碳源浓度、较高的无机氮源浓度可提高橙色素色价，有机氮源浓度过高则减少橙色素的产量。发酵培养基中添加较多量的萃取剂时能显著提高橙色素色价。当以木薯淀粉70，硫酸铵8，NaN036，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁1，磷酸二氢钾I ;萃取相(基本培养基的体积比):大豆油10%、玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%时，色价最高可达到450-460U/mL。这种新的发酵方法，适用于能够产红曲橙色素的各种红曲菌(紫色红曲菌Monascus purpureus CICC5022,红色红曲菌 Monascus rubber CICC40711),通过在发酵产生产物的同时通过萃取剂将产物红曲橙色素及时分泌到菌丝体外，一方面减少红曲橙色素进一步向红曲黄色素或红曲红色素的转化，一方面降低红曲色素产物的负反馈抑制作用，进一步又对橙色素进行萃取富集。此外，由于萃取相(油相)的存在该双液相体系不但能大大提高培养基溶氧。而在后期色素分离过程中，可简化色素的提取纯化工艺，萃取剂可回收重复利用，从降低了生产成本。综上，本发明中的这种方法是一种高效、经济、具备创新性的发酵方法，在红曲橙色素生产领域具有工业化实用价值。
[0065]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，其特征在于，是将红曲菌种子接入发酵培养基中，发酵培养产红曲橙色素；所述发酵培养基是水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基本培养基含有木薯淀粉30-80g/L，酵母膏0.l_6g/L，玉米浆粉0.l_6g/L，硫酸铵8-12g/L，硝酸钠5-10g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾 0.5-1.5g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质是甘油三酯类物质，添加的体积占基本培养基体积的5-30%。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯类物质为三辛酸甘油酯、三异辛酸甘油酯、植物油或其混合物。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油二酯类物质,是在红曲种子液接种24-72h之后添加，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5%。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油单酯类物质,是在红曲种子液接种24-72h之后添加，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5%。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油二酯类物质和甘油单酯类物质，甘油二酯和甘油单酯的总体积占基本培养基体积的0.1-5%,添加时间为红曲种子液接种24-72h之后。8.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述甘油二酯类物质是1，3-甘油二酯、1，2-甘油二酯、二辛酸甘油酯或其混合物。9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述甘油单酯是单辛酸甘油酯。10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物油是大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、棉籽柏油、茶籽油或其他食用油及其混合物。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养产红曲橙色素的条件是将处于对数生长期的红曲菌种子以体积比5-10%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为80?180r/min，温度26?32°C条件下，摇瓶发酵培养4_6d。
【专利摘要】本发明公开了一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，属于发酵工程领域。本发明方法以新颖的红曲菌液态发酵培养基为基础，由不溶于水的萃取相和基本培养基所组成发酵体系，一方面阻断橙色素向红曲红、黄色素的转化，从而提高红曲橙色素的转化率和产量；另一方面，双液相萃取发酵偶联体系有助于提高溶氧水平，保证红曲菌的正常生长和发酵，促进红曲色素分泌到细胞外，降低红曲发酵产物的负反馈抑制作用。采用本发明提供的方法，可在较短的发酵周期时间内实现红曲橙色素的高效生物合成、释放及萃取，从而能够显著提高红曲橙色素的产率及产量，并简化后续的色素提取纯化工艺，萃取剂还可重复回收使用，大大提高生产效率，降低生产成本。
【IPC分类】C09B61/00, C12R1/645, C12P23/00
【公开号】CN104946718
【申请号】CN201410117001
【发明人】许赣荣, 黄艳, 毛鹏, 张薄博, 贾虎斌
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月26日