DNA聚合酶lμl，10U/μlAMV反转录酶 1 μ 1，20 ymFIP 2 μ 1，20 μπι BIP 2yl，5ymF3 1μ1，5μηιΒ3 1μ1，10μηι LOOP-F 1 μ 1， 10 μπι LOOP-R 1 μ 1，样品 RNA5 μ 1，ddH20 2· 5 μ 1，共 25 μ 1。
[0024] 所述RT-LAMP反应的条件为：63°C反应40min，80°C灭活lOmin。
[0025] 所述染料为溴化乙淀或SYBR Green。
[0026] 所述待测样品为TSWV寄主植物或传播载体西花蓟马。
[0027] 权利要求2~6任一所述的方法在番茄斑萎病毒检测中的应用。
[0028] 本发明提供用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，包含独立包装或混装在 一起的一组特异引物FIP、BIP、F3、B3、L00P-F及L00P-R，其核苷酸序列如SEQIDN0·1~ NO. 6所示。所述引物结合番茄斑萎病毒S基因中的保守序列，特异性强，如图3所示，本发 明提供的特异引物与其它病毒基因或植物基因组无交叉反应，能够准确检测待测样品中是 否含有番前斑萎病毒。
[0029] 本发明还提供番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，该方法采用所述特异引物，以 待测样品的RNA为模板进行RT-LAMP反应，能够快速准确地检测样品中是否含有番茄斑萎 病毒。本发明提供的检测方法具有下述优点：（1)无需特殊仪器：只要有水浴锅或是金属浴 即可实现操作，适用于多种检测环境，既可以将样品带回实验室检测，也可以在野外直接检 测，十分方便；（2)检测时间短：只需40分钟即可判断待测样品中是否含有番茄斑萎病毒； (3)灵敏度高：能够检测低至7. 148 X KT5 μ g/ μ I RNA模板浓度的样本；(4)容易读取结果： 扩增完成后，只需加入EB或是SYBR Green等即可目测实验结果，判断待测样品中是否含有 番茄斑萎病毒。如需进一步确认，只需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增产物大 小为213bp，则待测样品中含有番茄斑萎病毒，反之亦然。
[0030] 番茄斑萎病毒引起的感染症状与很多其它病毒引起的症状非常相似，如西瓜花叶 病毒WMV，烟草花叶病毒TMV，番茄黄化曲叶病毒TYLCV，瓜类退绿黄化病毒病CCYV等，但其 危害和传播速度远远超过其它病毒。在野外考察或大田管理时，很难分辨属于哪种病毒感 染。采用本发明提供的检测方法，无需将大量样品带回实验室，即可快速判断待测样品是否 感染番茄斑萎病毒，从而迅速采取防疫措施，控制该病毒的传播，将其危害降至最低。既减 小了经济损失，又节约了时间及成本。
【附图说明】
[0031] 图I. RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的扩增曲线图，
[0032] 其中，1-7为5倍梯度稀释的RNA :处理1为L 1169 μ g/μL ;处理2为(λ 2234 μ g/ μ I ;处理 3 为 0· 0· 0447 μ g/ μ I ;处理 4 为 0· 0089 μ g/ μ I ;处理 5 为 0· 0018 μ g/ μ I ;处理 6 为 0· 00044 μ g/ μ I ;处理 7 为 7· 148X KT5 μ g/ μ I ;CK 为空白对照 ddH20。
[0033] 图2.番茄斑萎病毒RT-LAMP法检测结果，
[0034] 其中，图2A为8个样品经RT-LAMP法扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；图2B为扩 增后8个样品的目测浑浊度；图2C为添加 EB染料后自然光下的显色图；图2D为添加 EB 染料后在紫外灯下的显色图；图2. E为添加 SYBR Green染料后利用Molecular Imager ChemiDoc凝胶成像系统拍摄的照片；1-7为5倍梯度稀释的RNA :处理1为I. 1169 μ g/ μ I ; 处理 2 为 0· 2234 μ g/ μ I ;处理 3 为 0· 0· 0447 μ g/ μ I ;处理 4 为 0· 0089 μ g/ μ I ;处理 5 为 0· 0018 μ g/ μ 1 ;处理 6 为 0· 00044 μ g/ μ 1 ;处理 7 为 7. 148 X HT5 μ g/ μ I ;CK 为空白对照 CldH2O0
[0035] 图3. RT-LAMP引物的特异性验证，
[0036] 其中，图3A的泳道1为TSWV感染的辣椒、2为TSWV感染的曼陀罗、3为TYLCV感 染的番茄、4为TMV感染的辣椒、5为TMV感染的南瓜、6为CMV感染的辣椒、7为CMV感染的 番茄、8为无模板阴性对照。
[0037] 图3B的泳道1为本发明中的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的PCR反应产 物；泳道2为Aichi Prefecture等报道的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的PCR反应 产物。
[0038] 图4.利用RT-LAMP法检测单头西花蓟马中的TSWV，
[0039] 其中，图4A为扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，1~7为单头西花蓟马样品， CK为阴性对照；图4B为扩增产物添加 SYBR Green染料后自然光下的显色图，1~7为单头 西花蓟马样品，CK为阴性对照。
【具体实施方式】
[0040] 以下通过具体实施例对本发明进行详细解释，需要说明的是，下述实施例仅作为 解释和说明，而不能理解为对本发明的任何限制。
[0041] 病毒株系：番茄斑萎病毒（TSWV-YN)，由浙江省农科院植物保护与微生物研宄所 张治军副研宄员提供，采用人工摩擦的方法接种于曼陀罗（Datura stramonium)上活体保 存病毒。
[0042] 番茄黄化曲叶病毒TYLCV、烟草花叶病毒TMV以及黄瓜花叶病毒CMV，来源于中国 农业科学院蔬菜花丼研宄所植病组。
[0043] 上述病毒株系本实验室亦有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发 放用于必要的验证试验。
[0044] 植物材料：感染TSWV的辣椒及曼陀罗来源于中国农业科学院蔬菜花丼研宄所昆 虫组，感染TMV的辣椒及南瓜、感染CMV的辣椒及番茄、感染TYLCV的番茄，来源于中国农业 科学院蔬菜花丼研宄所植病组。
[0045] 主要仪器与试剂：
[0046] LAMP快速检测基因扩增系统，荣研生物科技（中国）有限公司；
[0047] Molecular Imager ChemiDoc 凝胶成像系统，美国 Bio-Rad 公司；
[0048] Trizol总RNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；
[0049] 植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；
[0050] TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒，琼脂糖，dNTP Mix (IOmM)，MgS04 (IOOMm)，宝生物工程（大连）有限公司；
[0051] 2 X ES Taq Master Mix，北京康为世纪生物科技有限公司；
[0052] Bst DNA聚合酶，纽英伦生物技术（北京）有限公司；
[0053] AMV反转录酶，美国Promega公司。
[0054] 本发明未特别说明的实验试剂，均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法 配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0055] 实施例1、TSWV RT-LAMP特异引物的获得
[0056] 1、引物设计与合成
[0057] 参考GenBank中登录的TSWV的S基因序列（GenBank !JF960237)，应用生物学软 件进行比对，选取保守序列，利用软件PrimerExpoer V4设计RT-LAMP检测引物，获得了 5000多组引物序列，从中筛选出50多组引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成后进 行PCR反应，进一步筛选特异引物，对PCR条件和体系进行反复调试，最终选到一组特异性 良好的引物，其核苷酸序列如下：
[0058] F3 :5' -TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3' ，
[0059] B3 :5, -CAAAGAAGTATGACACCAGG-3,，
[0060] FIP : 5，-AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3，，
[0061] BIP :5' -GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3'，
[0062] LOOP-F : 5，-CTTCATTCATTTCAATGC-3，，
[0063] LOOP-R : 5，-AGTTCTATGAA-3，。
[0064] 2、引物的特异性验证
[0065] 选择与TSWV病症相似的番茄黄化曲叶病毒TYLCV、烟草花叶病毒TMV以及黄瓜花 叶病毒CMV为对照，检验TSWV引物特异性。
[0066] (1)参照植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）说明书， 提取感染TYLCV的番茄的基因组DNA，用于引物特异性检测。
[0067] (2)按照下述植物总RNA提取方法，提取TSWV感染的辣椒及曼陀罗、TMV感染的辣 椒及南瓜、CMV感染的辣椒及番茄的植物总RNA :
[0068] 将约0. 1克植物样品在液氮中研磨成粉末，转移至I. 5ml RNase-free离心管中， 加入1ml Trizol试剂，涡旋震动混匀，室温静置5min，12000rpm，4°C离心5min，吸取350 μ 1 上清液至新的RNase-free离心管中，加入350 μ 1氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min， 12000rpm，4°C离心15min，将上层水相（400 μ 1)移至新离心管，加入400 μ 1异丙醇，轻柔混 勾，冰上静置5-10min，12000rpm，4°C离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底，加入1ml 75%乙 醇，轻轻振荡离心管，8000rpm，4°C离心5min，尽量除去上清，室温放置10-15min，晾干，用 30-40 μ I RNase-free CldH2O 溶解 RNA，存放于-80 °C 冰箱备用。
[0069] 然后参照 TaKaRa Pri