meScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书，将获得的植物总RNA反转录成cDNA，用于引物特异性检验。
[0070] (3)普通PCR检验RT-LAMP引物的特异性：
[0071] PCR 反应体系为 20 μ L :模板 2 μ L、F3 0· 5 μ L、B3 0· 5 μ L、2 X ES Taq MasterMix 10 μ L、ddH20 7 μ L0
[0072] ?0?程序为：94°0预变性51^11;94°0变性3〇8,58°0退火458,72°0延伸458,35个循 环；72°C终延伸5min。
[0073] 扩增产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0074] 实验结果表明，除TSWV感染的辣椒及曼陀罗（图3A，泳道1、2)有目的条带 (213bp)外，其他泳道（图3A，泳道3为感染TYLCV番茄，泳道4、5为感染TMV的辣椒及南 瓜，泳道6、7为感染CMV的辣椒及番茄，泳道8为无模板阴性对照）都没有扩增条带出现， 说明该TSWV RT-LAMP引物特异性强，与其它病毒基因组无交叉反应。图3B中，泳道1为本 发明中的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的扩增产物；泳道2为Aichi Prefecture等 设计的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的扩增产物，由图可知，文献报道的LAMP引物不 能与本实验中的TSWV病毒模板产生特异性条带，而本发明中的引物可以。
[0075] 实施例2、RT-LAMP法检测TSWV的灵敏度验证
[0076] 为检测该方法的灵敏性，将实施例1提取的TSWV感染的辣椒的总RNA模板5倍 稀释，共7个梯度（RNA浓度：处理1为1. 1169 μ g/μ 1 ;处理2为0. 2234 μ g/μ 1 ;处理 3 为 0· 0· 0447 μ g/ μ 1 ;处理 4 为 0· 0089 μ g/ μ 1 ;处理 5 为 0· 0018 μ g/ μ 1 ;处理 6 为 0. 00044 μ g/μ 1 ;处理7为7. 148Χ KT5yg/μ 1)，作为模板，采用实施例1合成的特异引 物，按照下列反应体系和反应条件进行RT-LAMP反应，设置无 RNA模板体系（以CldH2O代替 模板RNA)作为空白对照。
[0077] RT-LAMP 反应体系：dNTP Mix (IOmM) 3. 5 μ LMgSO4(IOOmM) 1. 5 μ 1，IOXThermoPol Buffer 2.5yl，Bst DNA 聚合酶（8000U/ml)lyl，AMV反转录酶（1〇υ/μ1)1μ1， FIP (20 μ m) 2 μ I，BIP (20 μ m) 2 μ I，F3 (5 μ m) 1 μ I，Β3 (5 μ m) 1 μ I，LOOP-F (10 μ m) 1 μ I， LOOP-R(K) μπι)1 μ 1，样品 RNA 5 μ 1，CldH2O 2.5 μ 1，共 25 μ 1。
[0078] RT-LAMP 反应条件：63°C反应 40min，80°C灭活 lOmin。
[0079] 所得产物首先目测其浑浊程度，然后取5 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物 加入SYBR Green染料观察颜色反应。
[0080] 结果表明，RT-LAMP法对RNA模板浓度敏感，可检测到低至7. 148X 10_5 μ g/ μ 1 RNA模板浓度的样本。如图1所示，除空白对照外，其它7个处理均有扩增曲线出现，且随着 模板浓度的降低，扩增起始时间后延。图2A为8个样品经RT-LAMP法扩增后的琼脂糖凝胶 电泳图，除阴性对照外，其它7个样品均出现扩增呈梯状产物，且与预期产物大小一致；图 2B为扩增后8个样品的目测浑浊度，可以明显看到，添加 RNA的样本比阴性对照明显浑浊； 图2C为添加 EB染料后自然光下的显色图，可以看到1-7号样本微微呈现荧光绿色；图2D 为添加 SYBR Green染料后在紫外灯下的显色图，可明显看到1-7号样本的荧光绿色，而阴 性对照为橙黄色；图2E为添加 SYBR Green染料后利用Molecular Imager ChemiDoc凝胶 成像系统拍摄的照片，可明显看到除阴性对照外，其它7个样本的扩增产物荧光影像。
[0081] 实施例3、利用RT-LAMP法检测单头西花蓟马中的TSWV
[0082] 1、单头西花蓟马总RNA提取
[0083] 将获毒后单头西花蓟马及未获毒单头西花蓟马置于RNase-free 1.5ml的离心 管中，每管中加入合适大小的DEPC水处理过的钢珠，然后再加入250 μ I Trizol试剂， 12, OOOrpm短离心lmin，将I. 5ml离心管置于全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48) 中，65Hz振荡lmin，样品室温放置5min ;加入50 μ 1氯仿混合物（氯仿：异戊醇=24:1)， 涡旋震荡混匀3min后，4 °C条件下，12000rpm离心10min，将上清液移至另一离心管中 (125 μ 1)，随后加入125 μ 1预冷的异丙醇，上下轻微颠倒混匀，室温温育IOmin后，4°C条 件下，12, OOOrpm离心10min ;弃上清，加入70%预冷的酒精（250 μ 1)洗绦，在4°C条件下， 12,000rpm离心5min ;弃酒精，在超净工作台通风干燥，最后加入8μ1 DEPC水溶解RNA。
[0084] 2、RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒
[0085] RT-LAMP 反应体系：dNTP Mix (IOmM) 3. 5 μ LMgSO4(IOOmM) 1. 5 μ 1，IOXThermoPol Buffer 2.5yl，Bst DNA 聚合酶（8000U/ml)lyl，AMV反转录酶（1〇υ/μ1)1μ1， FIP (20 μ m) 2 μ I，BIP (20 μ m) 2 μ I，F3 (5 μ m) 1 μ I，Β3 (5 μ m) 1 μ I，LOOP-F (10 μ m) 1 μ I， LOOP-R(K) μπι)1 μ 1，样品 RNA 5 μ 1，CldH2O 2.5 μ 1，共 25 μ 1。
[0086] RT-LAMP 反应条件：63°C反应 40min，80°C灭活 lOmin。
[0087] 所得产物取5 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物加入SYBR Green染料，观察 颜色反应。
[0088] 实验结果表明，RT-LAMP可检测单头西花蓟马中TSWV，如图4A所示，除阴性对照 外，其它7个样品均出现呈梯状的扩增产物，且与预期产物大小一致；图4B为添加 SYBR Green染料后自然光下的显色图，可以看到1-7号样本微微呈现荧光绿色。
【主权项】
1. 用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，其特征在于：包括独立包装或混装在 一起的特异引物，所述特异引物的核苷酸序列如下： F3 :5' -TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3' ； B3 :5' -CAAAGAAGTATGACACCAGG-3' ； FIP :5' -AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3' ； BIP :5' -GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3' ； LOOP-F :5' -CTTCATTCATTTCAATGC-3' ； LOOP-R :5' -AGTTCTATGAA-3'。2. 番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤： (1)提取待测样品的总RNA ; ⑵采用权利要求1所述的试剂盒中的特异引物，以步骤⑴获得的样品RNA为模板进 行RT-LAMP反应，得到扩增产物； (3)采用以下至少一种方法检测步骤（2)得到的扩增产物： 琼脂糖凝胶电泳检测：出现预期带型的样品的为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病 毒；所述预期带型指梯状条带，主条带大小为213bp ; 目测浑浊度：出现浑浊的反应管为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒； 在反应管中添加染料：目测出现染色信号的样品为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎 病毒。3. 根据权利要求2所述的检测方法，所述RT-LAMP反应的体系为：10mM dNTP Mix 3. 5 yl，IOOmM MgS041. 5 yl，IOXThermoPol Buffer 2.5 yl，8000U/ml Bst DNA 聚合酶 lyl，10U/yl AMV 反转录酶 lyl，20ym FIP 2yl，20ym BIP 2yl，5ym F31yl，5ym B31 y 1，10 ym L00P-F1 y 1，10 ym LOOP-R I y 1，样品 RNA5 y 1，ddH20 2. 5 y 1，共 25 y 1。4. 根据权利要求3所述的检测方法，所述RT-LAMP反应的条件为：63°C反应40min， 80°C灭活 IOmin。5. 根据权利要求2所述的检测方法，所述染料为溴化乙淀或SYBR Green。6. 根据权利要求2~5任一所述的检测方法，所述待测样品为TSWV寄主植物或传播载 体西花蓟马。7. 权利要求2~6任一所述的方法在番茄斑萎病毒检测中的应用。
【专利摘要】本发明“用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法”，涉及植物病毒检测领域。所述试剂盒包括独立包装或混装在一起的特异引物FIP、BIP、F3、B3、LOOP-F及LOOP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示。本发明提供的检测方法无需特殊仪器，只要有水浴锅或是金属浴即可实现操作；检测时间短，40分钟即可获得实验结果；灵敏度高，能够检测低至7.148×10-5μg/μl RNA模板浓度的样本；容易读取结果，扩增完成后，只需目测反应溶液的浑浊度或加入EB或SYBR Green等染料即可判断待测样品中是否含有番茄斑萎病毒。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104946796
【申请号】CN201510303245
【发明人】吴青君, 万岩然, 赵巍巍, 何秉青, 徐宝云, 谢文, 王少丽, 张友军
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月4日