素进行测序，而选用经碘乙酰胺烷基化修饰后的毒素肽作为测序样品，因为没有经碘乙酰胺修饰的半胱氨酸(cysteine)在214 nm波长检测下没有吸收值，观察不到信号，不便于准确定位半胱氨酸在多肽中的位置，而经修饰的半胱氨酸的PTH-CM-Cys出峰信号明显，在线HPLC检测能够确证多肽序列中半胱氨酸的位置。根据毒素分子量推测其含有氨基酸残基的数目，然后设定实际测序循环数，即I个空白循环+1个标准循环+氨基酸残基数目。
[0016]2、实验结果与分析
2.1 SPKP-X的分离纯化
由于广西缨毛蛛成分非常复杂，通常采用二维色谱的方法分离纯化毒素多肽:即首先经过阳离子交换分离粗毒后，洗脱成分进一步采用反相HPLC分离纯化。二维色谱是一种非常有效的分离纯化的方法，通过阳离子交换HPLC以及反相HPLC两步分离，我们从广西缨毛蛛粗毒中成功分离到SPKP-Χ。图1是广西缨毛蛛粗毒的阳离子交换HPLC图谱，在280nm波长下检测，可观察到9个非常明显的洗脱峰，其中第9个峰是目的峰。收集此峰后，在AKTA纯化系统上进行脱盐处理所得图谱见图2。收集目的峰并冷冻干燥后，在Alliance系统上进行再次反相HPLC (见图3)。图中显示含SPKP-X的洗脱峰为单一峰，通过质谱鉴定它们的纯度达到98%以上。
[0017]2.2质谱分析
将图4所示洗脱峰用MALD1-T0F质谱分析表明所含组分单一。用HWTX-1进行内标校正，经鉴定SPKP-X的分子量分别为3706.2 Da。从图上看，样品很纯，说明目的肽的分离纯化是很成功的。
[0018]2.3氨基酸序列分析
SPKP-X的序列测定在491-A测序仪上进行。测序之前对SPKP-X进行碘乙酰胺烷基化修饰，结果表明，SPKP-X是单链多肽分子，由31个氨基酸残基组成，其中包括6个Cys。将该多肽经碘乙酰胺修饰后测定分子质量，修饰后的分子量比天然肽的分子量都增加了 348Da。由于每修饰一个半胱氨酸，则天然毒素的分子量增加58 Da，由此推断:SPKP-X含有6个半胱氨酸，形成三对二硫键。
[0019]SPKP-X的序列排列模式为CX6CX5CXtl CX4CX6C (其中X代表除半胱氨酸残基之外的任何一种氨基酸，数字代表氨基酸的个数)，这种模式符合ICK模型定义:CX3_7CX4_6CXQ_5CXQ_4CX3_13C。根据序列同源性比对分析，除了同从 Gorem1ciwmis Validus中分离得到的CvTX-1I和来源于Grammns to la,毒液的omega-GsTx SIA分别有61%和40%的序列相似性外，SPKP-X与其他已知毒素序列相似性都比较低，说明SPKP-X是新发现的一个序列独特的蜘蛛毒素分子。尽管如此，SPKP-X与其它ICK模体毒素半胱氨酸残基位置非常保守，我们推测SPKP-X也是一种ICK模体多肽毒素。
[0020]2.4 SPKP-X的同源结构模建
由于SPKP-X与omega-GsTx SIA有40%的序列相似性，故以omega-GsTx SIA的结构为模板，对SPKP-X进行了结构模建。该分子与其它离子通道毒素一样，具有二链反平行b —折叠片的二级结构，分子属于典型的ICK结模体。这些毒素都具有类似的二硫键配对方式及相似的三维空间结构，同属于ICK模体家族，结构的相似性为研宄SPKP-X的生物学活性提供了重要的线索。
【主权项】
1.一种从广西缨毛蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钾肽-X (spkp-χ)，其氨基酸序列为:NH2-Leu Cys Ser Arg Glu Gly Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Arg Lys Cys Cys AlaGly Phe Tyr Cys Lys Ala Phe Val Leu His Cys Tyr Arg Asn-OH02.根据权利要求1所述的从广西缨毛蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，其特征在于，所述的蜘蛛抑钾肽-X的N端第I位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括: Cl)①将粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 OOOrpm离心5 min,置于4°C保存；粗毒上样阳离子交换HPLC进行第一步分离；采用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia公司的Hiprep?16/10 CM FF预装柱进行分离；486检测器检测，检测波长为215nm ;流动相为四相洗脱系统，流速为3 mL/min ;洗脱液分别为A相0.1M磷酸二氢钠，B相0.1M磷酸氢二钠，C相IM氯化钠，D相双蒸水(ddH20);其中A液和B液用来调节洗脱液的PH值，采用氯化钠梯度洗脱；上述经阳离子交换HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化；(2)反相高效液相色谱分离脱盐纯化:在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的C18反相制备柱；③第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱(218TP54, 4.6X250 mm)于分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脱速度为lmL/min，柱温为40°C ； (2)通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPKP-X，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为3706.2 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由31个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键；多肽SPKP-X纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。
【专利摘要】本发明公开了一种制备新型生物活性多肽的方法，得到的这种新型生物活性多肽，名称为蜘蛛抑钾肽-X（SPKP-X），是通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得，其一级结构由31个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，分子量为3726.2Da，该多肽纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。
【IPC分类】C07K14/435, C07K1/18, C07K1/20
【公开号】CN104987372
【申请号】CN201510396410
【发明人】邓梅春, 罗旋
【申请人】长沙沁才生物科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月8日