下游引物 gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0092] 上游引物 blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0093] 下游引物 blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0094] 实施例6
[0095] 本发明试剂盒中制备20uL反应体系由W下组分组成：
[0096]
[0097] 其中引物序列如下：
[0098] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0099] 下游引物 gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0100] 上游引物 blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[010U 下游引物 blazR ;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0102] 实施例7
[0103] 本发明试剂盒中制备20uL反应体系由W下组分组成：
[0104]
[0105] 其中引物序列如下：
[0106] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0107] 下游引物 gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0108] 上游引物 blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0109] 下游引物 blazR ;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0110] 实施例8
[0111] 本发明检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，包括W下步骤：
[011引 A、提取样品DNA;
[0113] B、对步骤A中的样品DNA进行巧光PCR扩增，其中反应体系由W下组分组成：
[0114]
[0115] 其中上下游引物序列为：
[0116] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0117] 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0118] 上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0119] 下游引物blazR ;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0120] 所述的巧光PCR扩增按W下步骤进行：
[0121] (1)92°C~96°C预变性 30s;
[0122] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0123] C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0124] 其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按W下步骤进行：
[0125] (1)92°C~96°C变性Imin;
[0126] (2) 40°C复性Imin;
[0127] (3)然后初始烙解温度60°C~65°C，开始程序升温烙解至92°C~96°C，并在烙解 过程中实时检测巧光信号，15~25次/秒。
[012引实施例4
[0129] 取1. 5血培养物1000化pm离屯、2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打 使之重新悬浮，800化/min离屯、3min，去尽上清，向沉淀中加入200y1的50mg/mL的溶菌 酶溶液、30yL10%SDS和15化的蛋白酶K，祸旋混匀后，于37°C温育比；加入lOOyL的 5mol/L化C1,充分混匀，再加入80ulCTAB/化C1溶液，混匀后再65°C温育lOmin;加入等 体积的酪/氯仿/异戊醇混匀，离屯、4-5min，将上清转入一只新管中，加入0. 8倍体积的异 丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1血的70%己醇洗漆后，加入TE溶液溶解沉淀。 取1yL提取物加入到W下反应体系.
[0130]
[0131]
[0132] 其中上下游引物序列为：
[0133]上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0134]下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC [01巧]上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0136]下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0137] 进行巧光PCR扩增，按W下步骤进行：
[013引（1)92°C~96°C预变性 30s;
[0139] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0140]A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0141] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按W下步骤进行：
[0142] (1)92°C~96°C变性Imin;
[0143] (2) 40°C复性Imin;
[0144](3)然后初始烙解温度60°C~65°C，开始程序升温烙解至92°C~96°C，并在烙解 过程中实时检测巧光信号，15~25次/秒。
[0145] 本发明中标准DNA模版的制备；
[0146]W常规PCR方法扩增目的基因gl巧和blaz。PCR产物经1%凝胶电泳分析，采用 PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体PMD18-T连接，将连 接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培 养，提取质粒，W提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提 取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0147] 结果分析
[014引如果样品巧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35,而且烙解曲线有一个特异性 波峰，Tm值为76. 85 + 0. 15°C，可判为金黄色葡萄球菌检测阳性。
[0149]如果样品巧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35,烙解曲线有一个特异性波峰， Tm值为78. 85 + 0. 15°C，可判为blaz检测阳性。
[0150] 如果样品巧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35,而且有两个波峰，Tm值分别为 71.45 + 0. 15°C和75. 16 + 0. 15°C，可判为金黄色葡萄球菌和blaz均检出阳性
[0151] 如果样品巧光PCR扩增曲线明显，35<Ct值<40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述烙解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0152] 如果样品巧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为金黄 色葡萄球菌和blaz均检测阴性。
[0153] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0154] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于0.Ipg，且具有很好 重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0. 95,说明该 方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0155] W上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征W及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，该些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz用的引物，其特征在于该引物的序列分 别为： 上游引物gltBF:TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC下游引物gltBR:GGATAATGAAGGGAAACC 上游引物blazF:ACTTCAACACCTGCTGCTT 下游引物blazR:ACTCTTGGCGGITTCACT〇2. -种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中 20yL反应体系包括以下组分： 终浓度1X的HRM反应预混液 10UL 终浓度0.5pmol/L的上游引物gltBF 0.05- 0.8uL 终浓度0.5pmol/L的下游引物gltBR 0.05- 0.8uL 终浓度0.5pmol/L的上游引物blazF 0.05- 0.9uL 终浓度0,5pmol/L的下游引物blazR 0.05-0.9UL DNA模版 1uL 水 补齐至20uL； 其中所述上游引物gltBF的序列：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC所述下游引物gltBR的序列：GGATAATGAAGGGAAACC 所述上游引物blazF的序列：ACTTCAACACCTGCTGCTT 所述下游引物blazR的序列：ACTCTTGGCGGTTTCACT。3. 根据权利要求2所述的一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该 试剂盒中20yL反应体系包括以下组分： 终浓度1X的HRM反应预混液 10UL 终浓度0.5pmol/L的上游引物gltBF 0.5uL 终浓度0.5pmol/L的下游引物gltBR 0.5uL 终浓度0.5pmol/L的上游引物blazF 0.5UL 终浓度0.5pmol/L的下游引物blazR 0.5uL DNA模版 1UL 水 补齐.牟:20uL。4. 一种检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于包括以下步骤： A、 提取样品DNA; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz的方法，其特征在于步骤 B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C预变性 30s; (2) 92°C~95°C变性 10s~30s，54°C~64°C退火 10s~30s，72°C10s~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 10s~30s。6. 根据权利要求5所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤C中所述 高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性lmin; (2) 40°〇复性11^11; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤A中所述 提取样品DNA的具体步骤如下： 取1. 5mL培养物lOOOOrpm离心2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打使之 重新悬浮，8000r/min离心3min，去尽上清，向沉淀中加入200y1的50mg/mL的溶菌酶溶 液、30yL10%SDS和15yL的蛋白酶K，涡旋混匀后，于37°C温育lh;加入100yL的5mol/ LNaCl，充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育lOmin;加入等体积的 酚或氯仿或异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0. 8倍体积的异丙醇， 轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用lmL的70%乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
【专利摘要】本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物、试剂盒及方法，引物：gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC；gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC；blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT；blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz的引物、试剂盒方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/14, C12Q1/68
【公开号】CN104988219
【申请号】CN201510359033
【发明人】蔡先全, 张宪臣, 卢俊文, 萧绮倩, 邱德义, 柏建山, 李蓉, 邱霞, 赵美转
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月25日