小时，将偶联肽链脱除保 护基团。然后将树脂滤除留下母液，加100mL乙醚析出多肽。用3000转/秒离心2min，沉 淀得到粗品多肽，重复洗涤离心后在真空干燥机里干燥，获得难溶多肽链-连接臂_亲水多 肽链粗品。
[0051] 将上述粗品用水/乙腈的混合液体溶解，于高效液相色谱装样进行分离提纯，经 过用H20/0. 1TFA%做水相，ACN/0. 1%TFA做有机相的梯度洗脱色谱体系分离提纯，收集目 标峰。把收集的目标峰用分析性高效液相色谱检测纯度。合格的样品用旋转蒸发仪浓缩，放 冰箱预冻成固体。最后放入真空冷冻干燥机冻干，获得纯品ILVLLIII-HMBA-DDDDDEEKEEEE。
[0052] 将上述纯品用LiOH饱和溶液进行酯键水解，常温下反应3小时后，目标多肽链 ILVLLIII析出，而增加的序列HMBA-DDDDDEEKEEEE由于亲水性强且整个多肽呈酸性，将溶 解在LiOH溶液中，然后将析出的目标多肽经过过滤冻干即可得到成品。
[0053] 上述反应中，Fmoc氨基酸购于吉尔生化，生产批号GLS141015-4071、DICHobtDMAP 购于苏州昊帆、HMBA购于吉尔生化，TFA、TIS、EDT、乙醚、哌啶、DMF均购于南京晚晴。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例针对难溶多肽ILVLLIII进行分离纯化，连接臂选用4-(2-羟乙基）苯 甲酸（HPA)，通过连接臂连接RRRRREDKKKKK亲水多肽链。其中，D表示天冬氨酸，疏水参 数-3. 5,利用OtBu保护官能团；E表示谷氨酸，疏水参数-3. 5,利用OtBu保护官能团；K表 示赖氨酸，疏水参数-3. 9,利用Boc保护官能团，R表示精氨酸，疏水参数-4. 5,利用Pbf保 护官能团；这些氨基酸都采用Fmoc保护a-氨基进行固相合成。如图2所示，具体合成步 骤如下：
[0056]称取IgFmoc-Lys(Boc)-Wangresin树脂，执行[操作A]，即：加入哌啶：DMF= 1:4 (体积比）移除N端的Fmoc保护基团，温度控制在30°C，反应20分钟，反应后利用DMF/ 甲醇各洗涤3次，利用茚三酮检测试剂检测，颜色为蓝色表示反应完全。
[0057] 然后执行[操作B]，S卩：加入初始树脂摩尔数两倍的DIC和H0BT，以及两倍量的具 有保护基团的氨基酸反应1小时，温度控制在30°C，反应结束后用DMF洗涤3次后，用茚三 酮检测颜色为无色，则说明反应完全。
[0058] 后续以[操作A]、[操作B]交替进行，只是在[操作B]中所加入的亲氨基酸 随着合成顺序的进行更换。其中具有保护基团的赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸分别 为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 如此反应直到连接完HPA，用茚三酮溶液验色为无色即说明反应完成。以上反应即获得 X-Ph-Y- (B)n的亲水偶联肽链。
[0059] 基于上述获得的肽链，直接进行[操作B]，此处操作时，先加入DIC和H0BT，再加 入DMAP，且DMP的加入量仅为加入氨基酸摩尔倍数的十分之一，在30°C下反应时间延长至 5小时。并在后续步骤与[操作A]交替，直至获得王氏树脂-难溶多肽链-连接臂-亲水 多肽链。
[0060] 然后用IOmlTFA:TIS:EDT= 95% :3% :2%裂解树脂2小时，将偶联肽链脱除保 护基团。然后将树脂滤除留下母液，加100mL乙醚析出多肽。用3000转/秒离心2min，沉 淀得到粗品多肽，重复洗涤离心后在真空干燥机里干燥，获得难溶多肽链-连接臂_亲水多 肽链粗品。
[0061] 将上述粗品用水/乙腈的混合液体溶解，于高效液相色谱装样进行分离提纯，经 过用H20/0. 1TFA%做水相，ACN/0. 1%TFA做有机相的梯度洗脱色谱体系分离提纯，收集目 标峰。把收集的目标峰用分析性高效液相色谱检测纯度。合格的样品用旋转蒸发仪浓缩，放 冰箱预冻成固体。最后放入真空冷冻干燥机冻干，获得纯品ILVLLIII-HPA-RRRRREDKKKKK。
[0062] 将上述纯品用LiOH饱和溶液进行酯键水解，常温下反应3小时后，目标多肽链 ILVLLIII析出，而增加的序列HPA-RRRRREDKKKKK由于亲水性强且整个多肽呈酸性，将溶解 在LiOH溶液中，然后将析出的目标多肽经过过滤冻干即可得到成品。
[0063] 试验例
[0064] 本试验针对各组的肽链分别评判其在DMF溶液、DMSO溶液、HPLC中ACN:H2O(1:3) 溶液、以及LiOH饱和溶液下，2mg/mL的溶解能力。上述实施例1、2中的难溶多肽链-连接 臂-亲水多肽链分别作为组1、组2,单独的难溶多肽链ILVLLIII作为对照组。如表3所 示：
[0065] 表3难溶多肽连处理后的溶解能力评价
[0066]
[0067] 目标肽链的序列为：ILVLLIII，在DMF、DMS0和常用HPLC纯化条件ACN=H2O=I:3 溶解后十分浑浊且有固体析出。ILVLLIII4-HMBA-DDDDDEEKEEEE在DMF、DMSO和常用HPLC 纯化条件ACN:H20(1:3)溶解后均十分清澈且无固体析出。而ILVLLIII-HPA-RRRRREDKKKKK 在ACN:H2O(1:3)中完全溶解，但在DMF和DMSO中仍有固形物析出。
[0068] 对于第一组和第二组的肽链溶解在LiOH饱和溶液中，要求最好加入的时候能完 全溶解，然后等反应3小时后，难溶多肽链水解析出固体。而第二组的溶解效果显然没有第 一组好，会导致产品产率下降。可见第一组亲水多肽链的氨基酸结构更利于最后难溶多肽 链的析出。
[0069] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 利用王氏树脂为起始树脂，采用固相合成法逐一偶联具有保护基团的亲水氨基酸， 每当偶联一个被保护的亲水氨基酸后，加入DIC和HOBt进行缩合，反应完全后洗涤，再偶联 下一个被保护的亲水氨基酸，获得王氏树脂-亲水多肽链； (2) 向步骤⑴获得的产物中加入连接臂至缩合反应完全； (3) 逐一加入具有保护基团的难溶氨基酸，每当偶联一个具有保护基团的难溶氨基酸， 加入DIC和HOBt进行缩合，反应完全后洗涤，再偶联下一个被保护的难溶氨基酸，直至偶联 到最后一个难溶氨基酸； (4) 加入切割剂裂解树脂，取过滤母液加入乙醚析出，离心沉淀获得亲水多肽-连接 臂-疏水多肽粗品； (5) 将上一步骤获得的粗品多肽溶解，利用高效液相色谱分离提纯； (6) 将纯化后的粗品多肽用LiOH饱和溶液进行酯键水解，析出难溶多肽。2. 根据权利要求1所述的一种难溶多肽的合成_分离纯化方法，其特征在于：所述步 骤（1)和步骤（3)中，加入具有保护基团的亲水氨基酸或难溶氨基酸后，在30°C下反应1小 时。3. 根据权利要求2所述的一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，其特征在于：所述步 骤（3)中，加入第一个具有保护基团的难溶氨基酸时，还加入了 DMP并在30°C下缩合反应 5小时。4. 根据权利要求1所述的一种难溶多肽的合成_分离纯化方法，其特征在于：所述连 接臂是1，4位分别被羟基烷基和羧基烷基取代的苯化合物。5. 根据权利要求4所述的一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，其特征在于：所述连 接臂来自4-羟基苯甲酸、对羟甲基苯甲酸、4-(2-羟乙基）苯甲酸、4-(3-羟基丙基）苯甲 酸、4-(4-羟基丁基）苯甲酸、对羟基苯乙酸、4-(羟甲基）苯乙酸、对羟基苯丙酸、3-[4-(羟 基甲基）苯基]丙酸、4-(4-羟基苯基）丁酸、2-(4-羟基苯）丙酸、3-(4-羟基苯基）丁酸、 2_[ (4-羟基苯基）甲基]氨基丁酸、4-(1-羟基乙基）-苯甲酸的任意一种。6. 根据权利要求1所述的一种难溶多肽的合成_分离纯化方法，其特征在于：所述亲 水多肽链为不同亲水氨基酸脱水缩合而成。7. 根据权利要求6所述的一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，其特征在于：所述亲 水氨基酸是精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸的任意 一种。8. 根据权利要求7所述的一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，其特征在于：所述谷 氨酸和/或天冬氨酸总数目占总氨基酸数目的30 %~80%。9. 根据权利要求1所述的一种难溶多肽的合成_分离纯化方法，其特征在于：所述切 割剂为TFA、Tis、EDT，体积比为95 :3 :2。
【专利摘要】本发明公开了一种难溶多肽的合成-分离纯化方法，先通过固相合成将难溶多肽链和亲水多肽连偶联，实现难溶多肽在高效液相色谱中的溶解，再利用LiOH饱和溶液水解酯键断开难溶多肽链和亲水多肽链，使目标肽链直接析出，具有简易、高效的特点，用该方法获得的难溶多肽产品完全可以达到客户要求标准。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/04, C07K1/12, C07K1/06
【公开号】CN105001298
【申请号】CN201510466322
【发明人】周彬, 查建生, 潘奕, 徐金荣, 康武
【申请人】南京斯拜科生化实业有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月31日