除菌剂（头孢霉 素）的液体芽诱导培养基（B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3%蔗糖（3g/100ml)， 0.598叶12-吗啉乙磺酸，1.71^.1/6-84，10011^叶 1头孢霉素，0.8%琼脂，？115.6)清洗两 次，用无菌滤纸吸干子叶节，接种在添加了除菌剂的芽诱导培养基上，进行恢复培养。
[0158] 在芽诱导培养基上培养7d后，将其转入含有草丁膦（PPT)浓度为5mg*L1的芽诱 导培养基（即筛选培养基）中进行筛选7d。培养条件为：温度24±1°C;光周期为16/8h。
[0159] 4、抗性芽的伸长和生根
[0160]将通过步骤3筛选得到的外植体转入芽伸长培养基（MS大量盐和微量盐，MS铁盐， B5 维生素，3%蔗糖（3g/100ml)，0. 59g?L 吗啉乙磺酸，0? 5mg?L1GASJ.Img?L1IAA, Img?L1玉米素（ZR)，50mg?L1L-天冬酰胺，IOOmg?L-IL-焦谷氨酸，IOOmg?L1头孢霉 素，0.8% (0.8g/100ml)琼脂，pH5.6)中，转入时切掉子叶以及下胚轴基部的老化组织，每 7d继代一次。当芽伸长至3~4cm时，将其贴根剪下，转入生根培养基（1/2浓度的B5大量 盐和微量盐，MS铁盐，2% (2g/100ml)蔗糖，0.598.1^2-吗啉乙磺酸，Img*L1IAB, 0.8% (0. 8g/100ml)琼脂，pH= 5. 6)中进行生根培养。培养条件为：温度24±1°C;光周期为 16/8h〇
[0161] 5、抗性植株的驯化
[0162] 待根足够发达后，洗净根部的培养基，将小苗移入液体培养液（1/2MS液体培养 基）中炼苗3~5d，同时打开瓶口，使无菌苗逐渐适应有菌的外界环境。然后将植株取出转 至蛭石中避光培养驯化，同时套袋以保湿，然后逐渐降低湿度、增强光照。待小植株成活后 转入正常的土壤中栽培，保持温、湿度和正常光照至结荚成熟，获得T。代转基因大豆种子。
[0163] 6、转基因大豆的分子鉴定
[0164] (I)T1代转基因大豆植株基因组DNA的PCR检测
[0165] 提取上述步骤5获得草丁膦抗性的转GmWRIl基因大豆植株和转入空载体 PCAMBIA3301的大豆植株叶片的基因组DNA，用引物tNos-F和引物tNos-R针对GmWRIl基 因进行PCR扩增。用引物BAR-F和引物BAR-R针对草丁膦抗性基因bar进行PCR扩增。同 时以重组表达载体pCAMBIA3301-GmWRIl替代模板作为阳性对照，以未转基因的大豆品种 东农50作为阴性对照，同时设置以水替代模板的空白对照。
[0166] tNos-F:CACGCACTAGTCGATCGTTCAAACATTTGGC
[0167] tNos-R:GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAACATAG
[0168] BAR-F:CCGGCAACAATTAATAGACT
[0169] BAR-R:TCCATAGTTGCCTGACTCCC
[0170] tNos终止子的PCR鉴定结果如图6所示，部分转GmWRI1基因大豆植株与阳性对照 一致，经PCR扩增可得到大小约为283p的目的条带。而空白对照、阴性对照大豆植株均没 有目的条带产生。转入空载体PCAMBIA3301的大豆植株的检测结果也为阳性。
[0171] Bar基因的PCR鉴定结果如图7所示，转GmWRIl基因大豆植株与阳性对照一致， 经PCR扩增可得到大小为513bp的目的片段，而空白对照和阴性对照均未扩增出目的条带。 转入空载体PCAMBIA3301的大豆植株的检测结果也为阳性。
[0172] 将经过上述两种PCR鉴定进一步表明转入GmWRIl基因的大豆植株命名为东农 50/pCAMBIA3301-GmWRIl。同时将转入空载体pCAMBIA3301的大豆植株命名为东农50/ PCAMBIA3301。
[0173] 将鉴定后的抗性转基因植株经生根，移栽后，正常生长结实。最后得到均有GmWRIl 基因表达的5个T1代转GmWRIl基因大豆株系，编号分别为Nl、N8、N9、N13和N14。
[0174] (2)T1代转基因大豆植株qRT-PCR检测
[0175] 分别提取T1代转GmWRIl基因大豆植株叶片总RNA进行RNA水平上的鉴定，具体 方法如下：提取1\代转GmWRIl基因大豆植株叶片总RNA(TRIzol?Reagent,Invitrogen 公司，货号15596026)，以大豆ACTIM基因作为内参基因，利用Real-timePCR试剂盒 SuperRealPreMix(SYBRGreen,天根公司，货号FP204)进行实时荧光定量PCR反应。用引 物Actin4-F和引物Actin4-R针对GmACTIM基因进行PCR扩增。用引物QGmWRII-F和引物QGmWRIl-R针对GmWRIl基因进行qRT-PCR扩增。同时以重组表达载体pCAMBIA3301-GmWRIl 替代模板作为阳性对照，以未转基因的大豆品种东农50作为阴性对照。
[0176] Actin4-F：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATT
[0177] Actin4-R：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA
[0178] QGmffRIl-F：CATCATAATGGTCGCTGGG
[0179] QGmffRIl-R：ATGTCAAAATTGGTCACTGCA
[0180] qRT-PCR鉴定结果显示，GmWRIl基因在转基因大豆各株系中表达量均显著高于野 生型大豆东农50。
[0181] 二、转GmWRIl基因大豆的功能分析
[0182] 按照实施例1步骤二中2的方法对步骤一获得的T1代转GmWRIl基因大豆植株进 行种子脂肪酸总含量分析。
[0183] 结果如表5所示，转GmWRIl基因的大豆种子脂肪酸总含量与未转基因的大豆品 种东农50相比均有提升，尤其是编号为N13的转GmWRIl基因大豆种子脂肪酸总含量为 19. 77%，与东农50相比上升幅度达15. 41 %，编号为N14的转GmWRI1基因大豆种子脂肪酸 总含量为19. 42%，而未转基因的大豆品种东农50 (CK)为17. 13%。转入空载体的大豆种 子脂肪酸总含量与野生型大豆植株一致，无显著差异。以上结果说明GmWRIl基因可以促进 大豆种子脂肪酸的积累。
[0184] 表5、T1代转GmWRIl基因大豆种子脂肪酸总含量
[0185]
[0186] 注：* 表不P〈0. 05 (Student'st-test)。
【主权项】
1. 蛋白质在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中的应用；所述蛋白质为下述Al)或 A2)或 A3): Al)氣基酸序列为序列2所不的蛋白质； A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基 得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白质； A3)在Al)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在调控植物产量和/或种子脂肪酸含量中 的应用； 所述生物材料，为下述Al)至A20)中的任一种： Al)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表达盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有Al)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有Al)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有Al)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下al)或a2)或 a3)所示的基因： al)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子； a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋 白质的cDNA分子或基因组DNA分子； a3)在严格条件下与al)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的 cDNA分子或基因组DNA分子。4. 根据权利要求1或2所述应用，其特征在于：所述产量为种子千粒重和/或种子体 积； 所述脂肪酸为油酸18:1和/或亚油酸18:2。5. 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子 叶植物。6. -种培育产量和/或种子脂肪酸含量增加的转基因植物的方法，包括向受体植物中 导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受 体植物相比产量和/或种子脂肪酸含量增加。7. 根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述产量为种子千粒重和/或种子体积；所 述脂肪酸为油酸18:1和/或亚油酸18:2。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因 的编码序列是序列表中序列1的DNA分子。9. 根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子 叶植物。10. 权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在培育产量和/或种子脂 肪酸含量增加植物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了GmWRI1在调控植物产量及种子脂肪酸含量中的应用。本发明所提供的蛋白质GmWRI1为：A1)氨基酸序列为序列的蛋白质；A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，可利用本发明的GmWRI1蛋白质及其编码基因培育植物产量及种子脂肪酸含量增加的转基因植物。
【IPC分类】C12N5/10, A01H5/00, C12N15/82, C12N15/29, C07K14/415, C12N1/21
【公开号】CN105001316
【申请号】CN201510446325
【发明人】王志坤, 李文滨, 刘珊珊, 李永光, 常健敏
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月27日