苯磺酸钠作为乳化剂，充分混匀成为乳剂。使用时将乳剂稀释至所 需浓度即可。
[0037] 实施例12 制备 I g Eustomoside 片剂： 称取实施例2制备得到的Eustomoside化合物0. 4 g，加入少许DMSO使之充分溶解； 然后再加入0.1 g小麦蛋白（粉)，加水充分搅拌混匀，然后加入40%淀粉作为赋形剂，充分 混匀，干燥后压制成为片剂。使用时将片剂溶解于水并稀释至所需浓度即可。
[0038] 实施例13 10 μ g/ml的TMV溶液制备： 吸取已经制备的100 μ g/ml的TMV母液lml，加入余量的磷酸缓冲液至终体积10 ml， 即得10 μ g/ml的TMV溶液。
[0039] 实施例14 Eustomoside对TMV侵染的预防保护作用：采用半叶枯斑法。选取健康且生长良好的 心叶烟，在暗室放置一夜。每棵烟苗挑选水平位置相同的3个叶片。将每个叶片的右半部 分均勾喷洒10 μ g/ml的Eustomoside溶液100 μ 1，左半部分喷洒100 μ 1含相同DMSO 浓度的蒸馏水，喷洒量以叶面全部浸湿而不下滴为准。4 h后将整个叶片均匀摩擦接种10 μ g/ml的TMV 200 μ 1。以8%宁南霉素水剂1000倍液为对照。每个处理3株烟共10片烟 叶。7天后分别统计左右叶片的枯斑数目并根据叶片上的枯斑数计算枯斑抑制率。化合物对 TMV侵染的抑制率=[(阳性对照枯斑数一化合物处理枯斑数）/阳性对照枯斑数Γ 100%。
[0040] 实验结果：表1为实施例1制备得到的化合物Eustomoside在10 μ g/ml浓度时 与对照药物宁南霉素在心叶烟上对TMV初侵染的抑制比较。由结果可知，实施例1制备得到 的化合物Eustomoside对TMV的平均抑制率为50. 7%，而宁南霉素对TMV的抑制率为49. 4%。 实施例1制备得到的Eustomoside对TMV初侵染的抑制效果略优于市售药物"宁南霉素"。
[0041] 表1 实施例1制备得到的Eustomoside与宁南霉素在心叶烟上对TMV的抑制率 比较
实施例15 分别以实施例2和实施例3制备得到的化合物Eustomoside对TMV侵染的预防保护作 用试验，方法与实施例14相同，结果均表明，本发明制备得到的Eustomoside对TMV初侵染 的抑制效果略优于市售药物"宁南霉素"。
[0042] 实施例16 Eustomoside对TMV侵染的钝化作用：采用半叶枯斑法。选取健康且生长良好的心叶 烟，在暗室放置一夜。每棵烟苗挑选水平位置相同的3个叶片。将每个叶片左半边部分摩擦 接种一定浓度的TMV，右半部分摩擦接种含有20 μ g/ml Eustomoside和TMV的混合液， 15 min后用无菌水冲洗干净。7天后统计左右叶片的枯斑数目并计算抑制率=[(阳性对照 组枯斑数一化合物处理组枯斑数）/阳性对照组枯斑数Γ 100%。
[0043] 实验结果：表2为实施例1制备得到的化合物Eustomoside在20 μ g/ml浓度时 与对照药物宁南霉素在心叶烟上对TMV的抑制率比较。由结果可知，实施例1制备得到的 化合物Eustomoside对TMV的平均抑制率为51. 9%，而宁南霉素对TMV的抑制率为56. 0%。 实施例1制备得到的Eustomoside通过体外对TMV的钝化而抑制其初侵染，其抑制效果略 低于市售药物"宁南霉素"，但是也有较好的抑制效果，平均抑制率超过了 50%。
[0044] 表2 实施例1制备得到的Eustomoside与宁南霉素在心叶烟上对TMV的抑制率 比较
实施例17 分别以实施例2和实施例3制备得到的化合物Eustomoside对TMV侵染的钝化作用试 验，方法与实施例16相同，结果均表明，本发明制备得到的Eustomoside通过体外对TMV的 钝化而抑制其初侵染，其抑制效果略低于市售药物"宁南霉素"，但是也有较好的抑制效果， 平均抑制率超过了 50%。
[0045] 实施例18 Eustomoside对TMV在烟苗上形成症状的影响：选取健康且生长良好的枯斑寄主心叶 烟，在暗室放置一夜。以10 μ g/ml的实施例1制备得到的Eustomoside溶液均匀喷洒在 叶面右半叶面上，左半叶面喷洒清水作对照，喷洒量以叶面全部浸湿而不下滴为准。4 h后 将整个叶片均匀摩擦接种10 μ g/ml的TMV 200 μ 1。以8%宁南霉素水剂1000倍液为对 照。接种TMV后第7天观察烟苗的症状。
[0046] 由于心叶烟属于TMV的枯斑寄主，可以通过比较只接种TMV的叶片和经化合物处 理叶片的枯斑数量及枯斑大小来判断化合物是否抑制了 TMV的初侵染。实验结果如图1所 示，用10 μ g/ml的实施例1制备得到的Eustomoside通过体外对TMV的钝化而抑制其初 侵染，其抑制效果略低于市售药物"宁南霉素"，但是也有较好的抑制效果，平均抑制率超过 了 50%〇
[0047] Eustomoside溶液处理烟苗后接种TMV，7天后发现用化合物处理的叶片上枯斑数 目显著少于阳性对照。实施例1制备得到的化合物Eustomoside可以显著抑制TMV对寄主 的初侵染，从而减少病毒进入寄主细胞并进一步复制和增值的机会，起到对寄主预防保护 的作用。
[0048] 实施例19 分别以实施例2和实施例3制备得到的化合物Eustomoside对TMV在烟苗上形成症状 的影响试验，结果均表明，本发明制备的化合物Eustomoside可以显著抑制TMV对寄主的初 侵染，从而减少病毒进入寄主细胞并进一步复制和增值的机会，起到对寄主预防保护的作 用。
【主权项】
1. 一种环烯醚萜类化合物，其特征在于所述的环烯醚萜类化合物是从西南獐牙菜中分 离得到，其分子式为C16H220n，结构式为：该化合物命名为：Eustomoside。2. -种权利要求1所述的环烯醚萜类化合物的制备方法，其特征在于是以西南獐牙菜 为原料，经原料处理、浸膏提取、有机溶剂萃取、洗脱、分离步骤制备得到，具体包括： A、 原料处理：取阴干的西南獐牙菜粉碎过50~100目筛备用； B、 浸膏提取：将前处理后的西南獐牙菜中加入固液体积比2~5倍的体积百分浓度 75~85%的甲醇超声提取5~10次，每次2~5h，合并提取液，过滤，减压浓缩提取液至相对密度 为1. 2~1. 3得到浸膏； C、 有机溶剂萃取：浸膏中加入固液体积比1~3倍的水搅拌5~30min至呈悬浮状，用与水 等体积的体积浓度95~100%的二氯甲烷溶液萃取2~5次，每次15~40min，将每次水溶萃取 液合并得到萃取液a; D、 洗脱：将萃取液a上MCI柱，用体积浓度70~80%的甲醇溶液洗脱，收集得到洗脱液 b，洗脱液b上大孔树脂柱，以体积配比0 :1~1:0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分 洗脱液并浓缩，合并相同的部分； E、 分离纯化：D步骤洗脱液的0:1部分经半制备柱分离纯化，即得到所述的环烯醚萜类 化合物--Eustomoside。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的大孔树脂柱为D900、 D130、D101、D201 或D301 中的一种。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的甲醇-水溶液的体积 配比为 0:1，9:1，8:2,6:4,3:7 和 1:0。5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于E步骤中所述的半制备柱为艾杰尔半 制备柱、HPLC半制备柱或日本唯美希半制备柱中的一种。6. -种权利要求1所述的环烯醚萜类化合物的制剂，其特征在于所述的环烯醚萜类化 合物中加入药用辅料和/或赋形剂制成水剂、片剂、颗粒剂或微乳剂。7. -种权利要求1所述的环烯醚萜类化合物的应用，其特征在于所述的环烯醚萜类化 合物在制备防治TMV药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种环烯醚萜类化合物及其制备方法、制剂与应用，所述的环烯醚萜类化合物是从西南獐牙菜中分离得到，其分子式为C16H22O11，结构式为：该化合物命名为：Eustomoside。制备方法是以西南獐牙菜为原料，经原料处理、浸膏提取、有机溶剂萃取、洗脱、分离步骤制备得到。制剂为所述的环烯醚萜类化合物中加入药用辅料和/或赋形剂制成水剂、片剂、颗粒剂或微乳剂。应用为所述的环烯醚萜类化合物在制备防治TMV药物中的应用。本发明药物制剂不仅对人畜无毒、无害，使用安全可靠，而且对防治TMV有较好的效果，可用于制备防治TMV的药物制剂。
【IPC分类】C07H17/04, A01N25/34, C07H1/08, A01N25/12, A01N25/04, A01P1/00, A01N43/90, A01N25/02
【公开号】CN105017354
【申请号】CN201510384806
【发明人】李干鹏, 陈永对, 张仲凯, 董家红, 左马怡, 曾亮, 张洁, 吴阔
【申请人】云南民族大学, 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月4日