粒，SpeI酶切pE-SUMOPro,回收、纯化酶切产物。 按照ρΕ-SUMOPro载体：PCR产物片段为1 :1的比例，用无缝连接酶于50°C连接15min，将 连接产物转化大肠杆菌感受态BL21 (DE3)，经氨苄青霉素筛选后，挑取单克隆菌落进行菌体 PCR检测（图2)，选取PCR检测阳性菌落，命名为SUMO-ZP。
[0037] 3、重组蛋白表达及纯化：
[0038] 将含有SUMO-ZP的大肠杆菌菌液，接种至LB培养液中，使用恒温摇床，37°C， 180rpm培养，待菌体OD值达到0. 6,加入终浓度ImM的IPTG，并将温度调至30°C，180rpm继 续培养6h。取50ml大肠杆菌菌液，放置在离心机，lOOOOrpm，lmin，弃上清收集菌体，加入 10ml PBS，重新悬浮菌体。将重新悬浮的菌体放置在冰浴中，使用超声破碎仪，进行菌体破 碎。将破碎处理后的菌液，放置在离心机中，12000rpm，10min，分别收集上清和沉淀，沉淀使 用10ml PBS重新悬浮，分别取两种溶液10 μ 1，加入10 μ I 2 X SDS缓冲液，沸水煮沸10min， 离心后，取上清进行SDS-PAGE检测，检测结果显示：上清中含有一条目的蛋白大小的条带 (图3)。将上清溶液，经Ni柱纯化后，进行SDS-PAGE检测，结果显示：能够纯化出目标蛋白 条带，与预测目的蛋白大小一致（图4)，其氨基酸序列为SEQ ID No :6所示。
[0039] 4、免疫动物：
[0040] 将纯化的重组蛋白与完全弗氏佐剂1:1混合，进行第一次免疫，第一次免疫后第 14天，将纯化的抗原与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第二次免疫，第二次免疫后第14天， 将纯化的抗原与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第三次免疫，第三次免疫后第14天，将纯化 的抗原与非完全弗氏佐剂1:1混合，进行第四次免疫进行；
[0041] 5、抗体分离及纯化：
[0042] 待第四次免疫后第10天，将免疫用青年新西兰大白兔（体重：6_7斤，购自芳缘养 殖场），采用颈动脉放血，将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲 将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，1000 Og离心10min，收集上清液 即为抗血清。使用康为世纪公司的Protein A+G Agarose试剂（货号：CW0349)纯化抗体， 具体步骤：
[0043] (1)在IOml抗体血清中加入100 μ 1充分重悬的Protein A+G Agarose，4°C缓慢 摇动3个小时；
[0044] (2) 2500rpm离心5分钟，小心吸除上清；
[0045] (3)用PBS洗涤沉淀5次，PBS的用量每次为IOml。洗涤时离心条件：2500rpm离 心5分钟，小心吸除上清。
[0046] (4)完成最后一次洗涤后，去除上清，检测产物纯度，产物抗体的纯度为86%。
[0047] 6、抗体检测：
[0048] 选取野生型拟南芥和ZFN3基因突变拟南芥为实验材料，使用康为世纪公司的植 物蛋白质提取试剂盒（货号：CW0885B)，分别提取总蛋白。具体步骤为：选取拟南芥叶片组 织大约l〇〇mg，放置在研钵中，加入抽提试剂0. 5ml，进行匀浆处理；匀浆后冰上孵育20分钟 后，利用低温高速冷冻离心机4°C 12, OOOrpm，离心20分钟；收集上清中的可溶性蛋白，放置 在4°C，待下一步实验。
[0049] 提取蛋白质，经SDS-PAGE电泳后，经半干转膜仪，转移至硝酸纤维素膜上，以5% 的脱脂奶粉（TBST缓冲液溶解）在4°C条件下，封闭2h ;加入纯化的多克隆抗体（1:5000)， 在4°C条件下，反应12h ;加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG抗体（1:2000)，在37°C条件 下，反应Ih ;采用化学发光显色，检测结果如图5所示，野生型拟南芥有一条单一清晰的杂 交条带，而突变体中没有检测信号（图5)。
[0050] 结果证明：本发明所制备的多克隆抗体，能够识别植物体内的ZFN3蛋白，而且能 够特异性地与拟南芥ZFN3蛋白结合。
[0051] 结论：上述实验结果表明，制备的拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体能够识别拟南芥中 的ZFN3蛋白，能够检测ZFN3蛋白，而不与植物体内的其他蛋白发生作用。该多克隆抗体， 可以作为ZFN3蛋白检测试剂，对ZFN3蛋白的功能鉴定具有重要的意义。
[0052] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤： (1) 构建含有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述 重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原； (2) 将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗 体。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体是将含有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得的。4. 根据权利2所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白抗原含有如SEQ ID No. 4和 SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列。5. 根据权利要求1、2或4所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白抗原含有如SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞。7. 根据权利要求1、2、4和6中任意一项所述的制备方法，其特征在于，免疫动物的步骤 包括4次免疫，首先将纯化的重组蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫动物，而后将 纯化的重组蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-4次免疫，每次免疫的时间间隔为 14天。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体为pE-SUMOpro。9. 利用权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体。10. 权利要求9所述的拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)构建含有SEQ？ID？No：1和SEQ？ID？No：2所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；(2)将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体。利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别拟南芥ZFN3蛋白，而不能识别拟南芥其他蛋白，在ZFN3蛋白的检测和功能鉴定具有广泛用途。ZFN3蛋白抗体的制备为在拟南芥中检测ZFN3蛋白及研究ZFN3蛋白功能具有一定的意义。
【IPC分类】C07K16/16, G01N33/53
【公开号】CN105017417
【申请号】CN201510409322
【发明人】晁跃辉, 韩烈保, 肖国增, 滕珂, 郭涛
【申请人】北京林业大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月13日