目。
[0113] 碳水化合物抗原分子：毒素蛋白分子的比率超过5:1的疫苗根据W下步骤制造：
[0114] (a)将10ml-25mlGloboH(可购自台湾浩鼎生技股份有限公司（0BI化arma),台 湾）及对硝基苯醋连接子（可购自台湾浩鼎生技股份有限公司（0BI化arma)，台湾）溶解 于25u1DMF(可购自西格巧II德单奇公司(Sigma-Al化ich)，美国）中。 阳11引 化）用2. 5ml憐酸盐缓冲液（亦即抑〉8的碱性缓冲液）溶解25mgDT。
[0116] (C)在室溫下将步骤（a)中的混合物添加至步骤（g)中的混合物中隔夜。所得混 合物具有8至9. 2之间的抑。
[0117] 结果：如藉由MALDI-T0FMS测定，10mlGloboH产生包含GloboH:DT(8:1)的疫 苗且25GloboH产生包含GloboH:DT(24:1)的疫苗。 阳1化]制备0PT-821皂素
[0119] 0PT-821皂素根据W下步骤自奎拉雅属皂树提取物提取：
[0120] (a)藉由大粒子C18逆相层析法预先过滤奎拉雅属皂树提取物，随后藉由基于二 氧化娃的制备型正相层析法来纯化。此举产生粗0PT-821。 阳121] 化）再次藉由大粒子C18逆相层析法预先过滤步骤（a)中的粗0PT-821，随后进行 逆相制备型HPLC。OPT-821物质依序藉由去盐及冻干制程制成。
[0122] 自奎拉雅属皂树的树皮提取的经纯化的0PT-821皂素藉由质谱分析。图5A中 1989. 01处的质量峰、图5B中1989. 12处的质量峰及1989. 13处的质量峰说明存在分子量 为约1989的化合物。分子量为约1989的化合物的摩尔比为：图5A中为89. 8%，图5B中为 96. 8%，及图5C中为87. 0%。类似地，图5A中1856. 97处的质量峰、图5B中1856. 02峰处 的质量峰及1857. 09处的质量峰说明存在分子量为约1857的化合物。分子量为约1857的 化合物的摩尔比为：图5A中为10. 2%，图5B中为3. 2%，及图5C中为13%。
[0123] 经纯化的0PT-821皂素进一步藉由层析法分析。图6为层析图LC-UV影像（管柱： PolyLCPolyHYDROXYETHYLA200*4. 6mm5ym，300A)。第一峰说明存在 1989VUA及B)化 合物及1857化合物VI(A及B)化合物（约65. 94% )，且第二峰说明存在1989V2 (A及B) 化合物及1857V2 (A及B)化合物（约34. 06% )。图7为层析图LC-MS影像（管柱：Waters Symme付y0DS150巧.1mm)。上部图中的峰1说明存在1989化合物V1B及V2B(约2. 2%)， 而峰4说明存在1989化合物VIA及V2A(约97. 8% )。下部图中的峰2说明存在1857化 合物V1B及1857化合物V2B(约1. 9% )且峰3说明存在1857化合物VIA及1857化合物 V2A。
[0124] 实例2 :具有较高碳水化合物/毒素蛋白质比率的疫苗的免疫原性及0PT-281皂 素的佐剂功效
[0125] 使用CL57B/6小鼠进行实例1中的GloboH/DT(8:1)疫苗的活体内免疫原性及 0PT-821皂素的佐剂功效的评估。
[0126] 约八周大的CL57B/6小鼠随机分成W下四个研究组： 阳127]
[0128] 在第一次注射的前或第0天及在各注射的后S天（亦即在第10天、第17天及第 24天），经眶后或面静脉不用抗凝血剂收集血液样品。血液样品经离屯、W分离血清与血细 胞。收集血清且储存在-2(TC下，其稍后藉由化ISA分析。将来自各小鼠的血清连续稀释 W用于抗GloboHIgG分析。将GloboH-神经酷胺涂布在分析板上隔夜，随后用IX阻 断缓冲液（西格玛（Sigma))阻断30分钟且用PBST洗涂。经稀释的血清样品添加至分析 板，在室溫（RT)下培育1小时且洗涂。将山羊抗小鼠IgG-AP二次抗体（南方生物技术公 司（SouthernBiotech))添加至样品中且在RT下培育45分钟。再次洗涂板，随后添加色 素原受质且在37°C下培育20分钟。藉由添加停止溶液终止反应。藉由板读取器（分子仪 器公司（MolecularDevice))在405皿波长下定量光学密度。Mann-Whitneyt测试用于统 计学分析。图lA及图IB显示所测试的疫苗的定量抗GloboHIgG效价。
[0129]结果：来自GloboH/DT(比率为8:1)免疫的小鼠的IgG效价显着高于具有C34 佐剂的GloboH/KLH的IgG效价（P<0. 01)。来自GloboH/DT(比率为8:1)免疫的小鼠的 IgG效价高于具有0PT-821皂素佐剂的GloboH/KLH的IgG效价。（参见图1 (A))。不管所 使用的载体蛋白的类型，0PT-821皂素相比于C34佐剂引起统计学上显着更高的IgG效价 (P<0. 05,参见图1A及图1B)。 阳130]实例3 :使用ADCC及CDC分析进行具有较高碳水化合物/毒素蛋白比率的疫苗的 免疫原性及0PT-281皂素的佐剂功效的评估 阳131]用表3中的疫苗免疫四组路易斯大鼠。
[0132] 表3:疫苗组合物 阳1；33]
[0134]用列于表3中的疫苗在第0天、第7天、第14天及第21天经皮下免疫大鼠。在 第一次注射之前（亦即第0天）及在第10天、第17天及第24天收集周边血液单核细胞 任BMC)及血浆。
[0135] 使用此项技术中已知的巧黄绿素AM释放法进行ADCC及CDC分析。程序描述如 下：
[0136] 用巧黄绿素AM标记标祀细胞
[0137] MCF-7乳癌细胞（标祀细胞）在补充有2mMk教酷胺酸、ImM丙酬酸钢及0.Olmg/ mL膜岛素、10%胎牛血清的最低必需培养基中培养。将标祀细胞添加至96孔板巧X103个 细胞/孔），且在潮湿的5%C〇2氛围中在37°C下培育隔夜。丢弃培养基且各孔用PBS洗涂 一次。将10化20M巧黄绿素-AM溶液添加至各孔中（每孔2nmol)且在潮湿的5%C〇2氛 围中在37°C下培育2小时。干燥上清液且各孔用PBS洗涂S次。
[0138] 用样品血浆培育标祀细胞 阳139] 样品血浆经热失活且将50L1/5X热失活的样品血浆添加至各孔中，除了 "完全释 放"及"背景"对照组。在添加50LPBMC或血清的后最终稀释倍数将为1/10X。板在37°C下 (避光）培育30分钟。 阳140] 用PBMC或补体培育标祀细胞
[0141]在培育之后，在ADCC分析中将50微升PBMC(2X106个细胞/mL)(针对E:T比率 为20:1)添加至各孔中，且在CDC分析中将50微升1/10X稀释的血清添加至各孔中，除了 "完全释放"及"背景"对照组。反应混合物在潮湿的5% C〇2氛围中在37°C下培育4小时。 在培育时间的最后15分钟，将含有2%化iton溶液的不含酪红的MEM(50微升）添加至"完 全释放"对照组中，且将不含酪红的MEM(50微升）添加至"背景"对照组中。板在lOOg下 离屯、5分钟，且随后将80微升上清液转移至96孔黑色板。在485nm激发及538nm发射波 长下量测蛋光。
[0142]图2A至图2D显示G2、G3及G4疫苗的活体内ADCC及CDC活性。 阳143]结果：如图2B及图2D中所说明，在第24天G3疫苗（具有0PT-821皂素佐剂）的ADCC及CDC活性比G2疫苗（不具有皂素佐剂）的ADCC及CDC活性高。如图2B及图2D中 所说明，在第24天G4疫苗（GloboH/DT比率为24:1)的ADCD及CDC活性比G3疫苗（Go化0 H/DT比率为8:1)的ADCD及CDC活性高。此等结果显示0PT-821皂素佐剂及碳水化合物抗 原/毒素蛋白比率超过5:1的疫苗增强且诱发更长久的ADCC及CDC反应。 阳144]实例4:具有较高碳水化合物/毒素蛋白比率的疫苗的免疫反应及0PT-821皂素 的佐剂功效 阳145]使用化57B/6小鼠或Ba化/c小鼠进行实例1中的Globo H/DT (8:1)及Globo H/ DT(16:1)疫苗及0PT-821皂素佐剂的活体内评估。 阳146]约八周大的化57B/6小鼠随机分成W下8个研究组： 阳147]
[0148] 在第一次注射之前或第0天，在第10天、第17天及第24天经后眶或面静脉不用 抗凝血剂收集血液样品。血液样品经离屯、W分离血清与血细胞。收集血清且储存在-20°C 下，其稍后藉由化ISA分析。将来自各小鼠的血清连续稀释W用于抗GloboHIgG及IgM分 析。图3A、图3B及图4显示所测试的疫苗的定量抗GloboHIgM及抗GloboHIgG效价。
[0149] 结果：具有OPT-821皂素佐剂的疫苗相比于具有C34佐剂的疫苗诱发统计学上显 着更多的抗GloboHIgM及抗GloboHIgG(参见图3A、图3B及图4)。W下为统计学显着 差异： 阳1加]?在第17天G3疫苗（0PT-821皂素）的IgM效价显着高于G5疫苗（C34)的IgM效价（P= 0. 02); 阳151] ?在第17天G1疫苗（0PT-821皂素）的IgM效价显着高于G6疫苗（C34)的IgM效价（P= 0. 03)，
[0152] ?在第24天G3疫苗（0PT-821皂素）的IgM效价显着高于G5疫苗（C34)的IgM 效价（P= 0. 03)，
[0153] ?在第17天G3疫苗（0PT-821皂素）的IgG效价显着高于G5疫苗（C34)的IgG 效价（P= 0.001)，
[0154]?在第17天G1疫苗（OPT-821皂素）的IgG效价显着高于G6疫苗（C34)的IgG 效价（P= 0. 003)， 阳1巧]?在第24天G3疫苗（0PT-821皂素）的IgG效价显着高于G5疫苗（C34)的IgG效价（P= 0. 003)，及 阳156]?在第24天G1疫苗（0PT-821皂素）的IgG效价显着高于G6疫苗（C34)的IgG效价（P= 0. 004)。 阳157] 此等结果说明0PT-821皂素佐剂相比于C34佐剂显着增强IgM及IgG反应。
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