专利名称：包含脂质体、抗原、多核苷酸和含疏水物质的连续相的载体的组合物的制作方法
技术领域：
本申请涉及包含脂质体、抗原、Poly I:C多核苷酸和含疏水物质的连续相的载体 的组合物，及其应用。
背景技术：
常规疫苗可以包含抗原、佐剂和药学可接受的载体。已知Poly I:C多核苷酸可 以用作佐剂。还已知脂质体可以用于疫苗组合物中(参见申请人的已授权的美国专利 6，793，923)。然而，就申请人的知识而言，本领域没有教导或暗示将抗原、Poly I:C多核苷 酸、脂质体和疏水性载体组合在疫苗组合物中。
发明内容
申请人:现在已经发现，与包含在水性载体中的Poly I:C多核苷酸的常规疫苗组合 物或包含脂质体、疏水性载体和明矾佐剂的组合物相比，包含抗原、Poly I:C多核苷酸、脂 质体和含疏水物质的连续相的载体的组合物可以出人意料地提供更高的抗体效价和更高 百分比的激活的或记忆性⑶8+T细胞。因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含(a)抗原；(b)脂质体；(C) Poly I:C多核苷酸；和(d)含疏水物质的连续相的载体。在另一个方面，本发明提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括以任意的顺 序合并a)抗原；(b)脂质体；(C)Poly I:C多核苷酸；和(d)含疏水物质的连续相的载体。 在一个实施方案中，所述抗原包封在脂质体中。在一个实施方案中，所述Poly I:C多核苷 酸包封在脂质体中。在另一个方面，本发明提供了根据上述方法制备的组合物。在另一个方面，本发明提供了包括将如上所述的组合物施用于受试者的方法。在 一个实施方案中，该方法是诱发该受试者中针对所述抗原的抗体应答或细胞介导的免疫应 答的方法。在结合附图评阅本发明的具体实施方案的下列描述后，本发明的其他方面和特征 对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
在附图中，其仅以实例的方式图示说明了本发明的实施方案图1是显示三组小鼠(n = 9或10)如下接种疫苗的结果的图1组小鼠用在配制成脂质体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗B，本发明)的30微升剂量中的1微克rHA和 4微克Poly I :C进行疫苗接种。2组小鼠用包含30微升剂量的脂质体/明矾/疏水性载体 制剂中的1微克rHA和60微克明矾的疫苗A进行处理。3组小鼠用1微克rHA和60微克 明矾/30微升剂量的对照明矾疫苗进行疫苗接种。体液免疫应答通过如本文所述的ELISA 测量。对于每个处理组，对于每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准 差。使用T检验(student T test)计算P值。图2是显示两组小鼠(n = 9或10)如下接种疫苗的结果的图1组小鼠用在配制 成脂质体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗B，本发明)的30微升剂量中的1微克rHA和 4微克Poly I :C进行疫苗接种。2组小鼠用1微克rHA和4微克Poly I:C/30微升剂量的 对照Poly I :C疫苗进行处理。体液免疫应答通过如本文所述的ELISA测量。对于每个处 理组，对于每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准差。使用T检验计 算P值。图3是显示两组小鼠(n = 8或9)如下接种疫苗的结果的图1组小鼠用单剂量的 在配制成冻干脂质体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗C，本发明)的50微升剂量中的1 微克rHA和10微克Poly I :C进行疫苗接种。2组小鼠用1微克rHA和100微克明矾/50 微升剂量的对照明矾疫苗进行处理；小鼠在疫苗接种后21天加强免疫。体液免疫应答通过 如本文所述的ELISA测量。对于每个处理组，对于每个时间点将终点抗体效价的IoglO值 进行平均并计算标准差。图4.在用配制在脂质体/Poly I: C/油性载体疫苗中的rHA抗原进行疫苗接种后 增强的抗rHA抗体应答。两组小鼠(n = 9或10)如下接种疫苗1组小鼠用在配制成脂质 体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗B，本发明)的30微升剂量中的1微克rHA和4微克 Poly I:C进行疫苗接种。2组小鼠用疫苗A，30微升剂量的脂质体/明矾/疏水性载体制 剂中的1微克rHA和60微克明矾进行处理。体液免疫应答通过如本文所述的ELISA测量。 对于每个处理组，对于每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准差。使 用T检验计算P值。图5.在用配制在脂质体/Poly I: C/油性载体疫苗中的rHA抗原进行疫苗接种后 增强的抗rHA抗体应答。两组小鼠(n = 9或10)如下接种疫苗1组小鼠用在配制成脂质 体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗B，本发明)的30微升剂量中的1微克rHA和4微 克Poly I:C进行疫苗接种。2组小鼠用1微克rHA和4微克Poly I:C/30微升剂量的对 照Poly I :C疫苗进行处理。体液免疫应答通过如本文所述的ELISA测量。对于每个处理 组，对于每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准差。使用T检验计算 P值。图6.在用配制在冻干脂质体/Poly I:C/油性载体疫苗中的rHA抗原进行疫苗接 种后增强的抗rHA抗体应答。两组小鼠(n = 9或10)如下接种疫苗1组小鼠用单剂量的 在配制成冻干脂质体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗D，本发明)的50微升剂量中的 1.5微克rHA和12. 5微克Polyl: C进行疫苗接种。2组小鼠用1.5微克rHA和100微克明 矾/50微升剂量的对照明矾疫苗进行处理；小鼠在疫苗接种后观天G周)加强免疫。体 液免疫应答通过如本文所述的ELISA测量。对于每个处理组，对于每个时间点将终点抗体 效价的IoglO值进行平均并计算标准差。使用T检验计算P值。
图7.疫苗接种后⑶8-阳性T细胞群内的抗原特异性⑶8细胞的数目。三组BALB/ c小鼠(n = 4)如下进行疫苗接种1组小鼠用在配制成冻干脂质体/Poly I C/疏水性载 体疫苗(疫苗D，本发明)的50微升剂量中的1. 5微克rHA和12. 5微克基于RNA的Poly I :C佐剂进行肌内疫苗接种。2组小鼠用50微升的疫苗D皮下接种。3组小鼠用在50微升 的50毫摩尔磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)中的1. 5微克rHA和100微克Liiject Alum佐剂进行 肌内接种。所有疫苗仅给予一次而不用加强免疫。在疫苗接种后22天使用三色流式细胞 分析在动物的脾细胞中检测抗原特异性CD8+T细胞。细胞用抗CD8 β -APC，抗CD19-FITC和 对携带rHA、I9L的优势免疫表位的H2_Dd特异的PE-五聚体进行染色。结果表示为CD8 β 阳性/CD19阴性细胞群的群体中五聚体阳性细胞的平均百分比，+/_标准差。减去在从原态 (naiVe)细胞中分离的脾细胞中检测的背景染色。与3组相比*P = < 0. 025，**P =<0. 005。图8.针对在本发明中配制的rHA的单次疫苗接种后的血凝抑制(HAI)效价。一 组小鼠和一组兔(n = 5)如下进行疫苗接种该组小鼠用在配制成冻干脂质体/Poly I:C/ 疏水性载体疫苗(疫苗Ε，本发明)的50微升剂量中的0.5微克rHA和12微克Poly I:C 进行疫苗接种。该组兔用在200微升剂量的冻干脂质体/Poly I:C/疏水性载体制剂中的 疫苗F(本发明)，2微克rHA和50微克Poly I :C进行处理。体液免疫应答通过如本文所 述的血凝抑制测定，在疫苗接种前(接种前)和接种后4周(兔)或5周(小鼠)进行测 量。对于每个处理组，将HAI效价的IoglO值进行平均并计算标准差。图9.在用配制在脂质体/Poly I:C/油性载体疫苗中的β -淀粉样蛋白和F21E 肽的混合物接种后增强的抗-β-淀粉样蛋白抗体应答。两组小鼠(η = 9)如下进行疫苗 接种1组小鼠用在配制成脂质体/明矾/疏水性载体疫苗(疫苗G)的100微升剂量中的 10微克β -淀粉样蛋白、20微克F21E和200微克明矾进行疫苗接种。2组小鼠用10微克 β-淀粉样蛋白、20微克F21E和10微克Poly I C/配制成脂质体/Poly I:C/疏水性载体 (疫苗H，本发明)的100微升剂量进行处理。体液免疫应答通过如本文所述的ELISA测定。 对于每个处理组，对每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准差。使用 T检验计算P值。图10.配制在脂质体/polyl:C/疏水性载体制剂中的疫苗能够引起细胞和体液 免疫应答。两组小鼠(n = 5)如下进行疫苗接种1组小鼠用在配制成冻干脂质体/Poly I C (高)/疏水性载体疫苗(疫苗E，本发明)的50微升剂量中的0. 5微克rHA和12微克 Poly I :C进行疫苗接种。2组小鼠用0.5微克rHA和2. 5微克Poly I: C/配制成冻干脂质 体/Poly I:C(低)/疏水性载体(疫苗I，本发明)的50微升剂量进行处理。体液(IgGl) 和细胞(IgG2A)免疫应答的指示剂通过如本文所述的ELISA进行测量。对于每个处理组， 对每个时间点将终点抗体效价的IoglO值进行平均并计算标准差。图11是显示用表达HPV16 E7的C3细胞植入并且在8天后如下进行疫苗接种的 C57BL/6小鼠的平均肿瘤体积的图1组小鼠用含有配制在具有疏水性载体的乳液中的15 微克FP抗原和150微克基于RNA的Poly I:C的100微升(对照乳剂疫苗)进行疫苗接 种。2组小鼠用含有配制在脂质体/Poly I: C/疏水性载体中的15微克FP抗原和150微克 Poly I:C的100微升(疫苗K，本发明)进行疫苗接种。3组小鼠仅接受100微升PBS。所 有组含8只小鼠。植入后一周一次测量肿瘤尺寸，测量5周。图11显示对每组计算的平均 肿瘤体积+/-SEM。使用T检验计算1组和2组的P值，Y =< 0. 1，**p =<0. 05。
图12是显示用表达HPV16E7的C3细胞植入并且在5天后如下进行疫苗接种的 C57BL/6小鼠的平均肿瘤体积的图1组小鼠接受含有配制在脂质体/Poly I:C/疏水性载 体中的10微克FP抗原和20微克基于DNA的Poly I C的100微升(疫苗L，本发明)。2 组小鼠接受含有配制在冻干脂质体/Poly I:C/疏水性载体中的10微克FP抗原和20微克 基于DNA的Poly I C的50微升(疫苗M，本发明)。3组小鼠接受含有配制在冻干脂质体 /疏水性载体中的10微克FP抗原的50微升(佐剂对照)。4组小鼠仅接受100微升PBS。 所有组含10只小鼠。植入后一周一次测量肿瘤尺寸，测量5周。图12显示对每组计算的 平均肿瘤体积+/-SEM。使用T检验计算2组和3组的P值，Y =< 0. 5。图13.在用配制在冻干脂质体/Poly I C/油性载体疫苗中的rHA抗原进行疫苗 接种后增强的抗rHA细胞应答。两组小鼠(η = 9或10)如下进行免疫1组小鼠用单剂量 的在配制成冻干脂质体/Poly I:C/疏水性载体疫苗(疫苗D，本发明)的50微升剂量中 的1. 5微克rHA和12. 5微克Poly I :C进行疫苗接种。2组小鼠用1. 5微克rHA和100微 克明矾/50微升剂量的对照明矾疫苗进行处理；小鼠在疫苗接种后观天G周)加强免疫。 抗原特异性细胞应答通过对H2-Kd表位IYSTVASSL特异的⑶8+T细胞的五聚体染色和流式 细胞术进行测量。如本发明所述进行疫苗接种的小鼠产生抗原特异性的长效细胞应答。使 用T检验计算P值。
具体实施例方式本申请涉及包含脂质体、抗原、Poly I:C多核苷酸和含疏水物质的连续相的载体 的组合物和它们的应用。与包含在水性载体中的Poly I:C多核苷酸的常规疫苗组合物或包含脂质体、疏水 性载体和明矾佐剂的组合物相比，将抗原、Poly I :C多核苷酸、脂质体和含疏水物质的连续 相的载体结合在一起的本发明组合物提供了令人惊讶地更高的抗体效价。实施例1和2中描述的数据总结在表1中表 1.
权利要求
1.一种组合物，包含(a)抗原；(b)脂质体；(C)Poly I :C多核苷酸；和(d)包含疏水物质的连续相的载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含RNA或DNA。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含RNA和DNA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述PolyI:C多核苷酸是均聚物或 杂聚物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含均聚的 Poly I :C多核苷酸和杂聚的Poly I :C多核苷酸。
6.一种制备组合物的方法，所述方法包括以任意的顺序组合 a)抗原；(b)脂质体；(C)Poly I :C多核苷酸；和(d)包含疏水物质的连续相的载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原包封在所述脂质体中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述PolyI C多核苷酸包封在所述脂质体中。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述PolyI C多核苷酸加在所述脂质体的外部。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法制备的组合物。
11.一种方法，包括将根据权利要求1-5和10中任一项所述的组合物施用于需要其的受试者。
12.根据权利要求11所述的方法，其是在所述受试者中诱发对所述抗原的抗体应答和 /或细胞介导的免疫应答的方法。
13.根据权利要求11所述的方法，其是用于治疗和/或预防由表达所述抗原的细菌、病 毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤细胞引起的疾病的方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗和/或预防包括诱发受试者中对所述 抗原的抗体和/或细胞介导的免疫应答，其中所述受试者患有病毒感染或处于发生病毒感 染的危险中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒感染是流感病毒感染。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗和/或预防包括诱发受试者中对所述 抗原的抗体和/或细胞介导的免疫应答，其中所述受试者患有癌症或处于发生癌症的危险 中。
17.根据权利要求11所述的方法，其是用于治疗和/或预防神经变性疾病的方法，其中 所述神经变性疾病与所述抗原的表达相关。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，其中所述组合物诱发受试者中的免疫应答为对照组合物诱发的应答的至少1. 5倍高。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物诱发受试者中的免疫应答为对照组 合物诱发的应答的至少5倍高。
21.根据权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物经下述途径施用鼻、 口咽、眼、口、直肠、舌下、泌尿生殖器粘膜、鼻内、口咽、气管内、肺内、经皮、经肺、动脉内、皮 内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或粘膜下。
全文摘要
本发明提供了一种组合物，其包含抗原；脂质体；Poly I:C多核苷酸；和包含疏水物质的连续相的载体。还提供了制备和使用该组合物的方法。
文档编号A61K9/127GK102056622SQ200980120883
公开日2011年5月11日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年6月5日
发明者A·富恩特斯-奥尔特加, G·M·威尔, L·D·麦克唐纳, L·萨玛特尔, M·卡尔柯达, M·曼索尔 申请人:免疫疫苗技术有限公司