环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的步骤完成。
[0023] 实施例3
根据图1示出的本发明一个实施方式利用纳米材料从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法，首先利用化学修饰方法(MPTMS，GMBS和St^ptavidin依次处理纳米基底I小时，45分钟和6小时)，再将带生物素基团的抗体滴加到基底上，纳米颗粒200与抗体201结合，制备修饰有特异性抗体的纳米颗粒基底。从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法首先进入孕妇外周血中胎儿有核红细胞的捕获步骤SllOO:从医院收取孕周为28周2天的孕妇静脉血保存在加有EDTA的采血管中，在6小时内，将孕妇外周血与PBS按1:1比例混匀后，缓慢滴加到密度为1.075g/ml的淋巴细胞分离液的表面后放置到水平转速离心机中400g离心处理30分钟，将离心后所得单核细胞分散在Iml PBS中，并滴加到修饰有抗体的纳米材料芯片上，于37°C细胞培养箱中静置I小时，胎儿有核红细胞300与基底抗体201发生特异性识别并被基底捕获，然后用PBS洗去未捕获到和物理性吸附的细胞后完成捕获过程；接下来进入利用FISH手段鉴定胎儿性别步骤S1200:针对捕获在芯片上的细胞，使用固定剂(甲醇和冰醋酸按体积比3:1混合)固定10分钟；然后在预热至37°C的2*SSC溶液中浸泡30分钟，接着分别使用70%、85%、100%的无水乙醇梯度脱水2分钟后自然干燥；然后现配的FISH探针杂交混合液(每个芯片2ul CSP-X/Y +8ul杂交缓冲液，连续混匀)后，滴加到芯片上，盖上盖玻片并用指甲油密封后，先在75°C中水浴5分钟，再在42°C烘箱中避光保存12小时以上，保证杂交完全；然后揭下盖玻片，小心去除芯片表面的杂交混合液后，放入2*SSC溶液中浸5分钟；再放置到预热至67V的0.3*NP-40/0.4*SSC溶液中浸泡90秒钟，然后放入0.1*NP_40/2*SSC溶液中浸泡30秒钟；接着在70%的乙醇溶液中脱水3分钟后自然干燥；再在杂交区域滴加DAPI，并在荧光显微镜下观测细胞核；然后进入对细胞鉴定结果的分析和记录步骤S1300:对细胞FISH结果进行观测(细胞核内出现的X和Y荧光信号)和记录(如分析和拍照)，未能在该血样中观察到Y信号；最后进入仪器清洗步骤S1400:观测完成后对实验过程中所使用的器材使用医用酒精消毒和去离子水清洗、烘干。至此步骤S1400结束，利用纳米材料从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的步骤完成。
[0024]根据本发明实施例1-3中利用从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法，能够简便有效地捕获12-28孕周的孕妇外周血中的胎儿有核红细胞并用于无创产前诊断，同时芯片的透明玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时原位观测；被捕获的细胞可保持良好的完整性便于进行后续分析；
通过图2示出的纳米材料芯片对孕妇外周血中分离出单核细胞的捕获示意图，可以看出胎儿有核红细胞300抗原与纳米颗粒200上的抗体特异性结合，从而实现捕获。
[0025]另外，对实施例2利用纳米材料芯片捕获胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法进行了分析和记录(如图2和图3所示)。
[0026]通过图3示出根据本发明方法从12份孕周为12-28周的孕妇外周血样本中捕获和鉴定的胎儿有核红细胞的统计结果，可以看出随着孕周的增加大致呈现先急剧增多，然后减少并趋于平缓的趋势。
[0027]通过图4示出根据本发明方法利用FISH技术从怀有男胎的外周血中胎儿有核红细胞核内检测Y信号并鉴定胎儿性别的荧光图。
[0028]应该注意的是，上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。
【主权项】
1.一种从孕妇母体外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法，包括: (1)新鲜孕妇外周血预处理步骤:利用密度梯度离心法从母体外周全血中分离富集出含有胎儿有核红细胞的单核细胞； (2)细胞捕获步骤:将分离出的单核细胞悬浮液加入到修饰了抗体的基底芯片上，静置捕获I小时； (3)FISH鉴定胎儿性别步骤:利用FISH探针技术(CSP-X/Y)鉴定捕获到的胎儿有核红细胞中的是否带有Y染色体。2.依据权利要求1的方法，还包括: 基底芯片的制备和修饰步骤:合成纳米颗粒并制备成膜，然后利用化学方法将特异性抗体修饰到基底芯片上。3.根据权利要求1的方法，还包括: 观察和记录步骤:对芯片上的捕获结果进行观测和记录。4.根据权利要求1的方法，还包括: 器材清洗和维护步骤，观测完成后对实验过程中所使用的器材使用医用酒精消毒和去离子水清洗、烘干等。5.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(I)中细胞离心所使用的是淋巴细胞分离液，密度为1.075g/ml一 1.090g/ml,离心力为400g，离心时间为30min。6.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(I)中离心后所得单核细胞是分散在Iml磷酸盐缓冲液PBS中。7.根据权利要求2的方法，其中纳米基底芯片包括但不仅限于Silicon，S12,MnO2,T12, ZnO, ZrO2, SnO2，轻基磷灰石颗粒和聚苯乙稀微球等纳米材料，使用的特异性抗体包括但不仅限于 CD14，CD32，CD35，CD36，CD45，CD47，CD71，CD147，GPA 和 EPO-r 等。8.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(2)加入单核细胞悬浮液后，细胞捕获过程是在37 °C恒温细胞培养箱中进行以保持细胞的活性。9.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(4)中FISH技术的流程为:步骤(2)完成细胞捕获后，使用固定剂(甲醇和冰醋酸按体积比3:1混合)固定1min ;然后在预热至37 °C的2*SSC溶液中浸泡30min ;接着分别使用70%、85%、100%的乙醇梯度脱水2min后自然干燥；再滴加上现配的FISH探针杂交混合液(2ul CSP-X/Y +8ul杂交缓冲液，连续混匀)后，先在75°C下水浴5min，再在42°C下杂交过夜；小心去除芯片表面的杂交混合液后，放入2*SSC溶液中浸5min ;再放置到预热至67°C的0.3*NP_40/0.4*SSC溶液中浸泡1.5min，然后放入0.l*NP-40/2*SSC溶液中浸泡0.5min ;接着在70%的乙醇溶液中脱水3min后自然干燥；然后在杂交区域滴加DAPI，在荧光显微镜下观测细胞核。10.根据权利要求9的方法，其中FISH技术的操作都是针对基底芯片捕获上的细胞，与标准的FISH分析有所区别。
【专利摘要】本发明公开了一种利用从孕妇母体外周循环血中分离出的胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法。包括：新鲜孕妇母体外周血预处理步骤：利用密度梯度离心法从母体外周全血中分离富集出含有胎儿有核红细胞的单核细胞；细胞捕获步骤：将分离出的单核细胞悬浮液加入到修饰了抗体的基底芯片上，静置捕获。胎儿性别鉴定步骤：利用FISH探针技术（CSP-X/Y）鉴定捕获到的胎儿有核红细胞中的是否带有Y染色体。根据本发明的利用从孕妇母体外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法能够实现从母体外周全血中捕获和鉴别出胎儿有核红细胞，并且还可以直接进行FISH分析，对胎儿的性别或21-三体综合症等染色体疾病进行无创的产前诊断。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105063181
【申请号】CN201510388146
【发明人】石莹
【申请人】石莹
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月3日