DNA片段；之后，双链DNA 片段变性为两条单链DNA，上下游通用引物分别与两条单链DNA片段反向互补配对结合，即 开始常规的单重对称PCR过程，产生大量双链DNA片段； 图4为HPV16型单一型别感染样本检测结果图； 图5为HPV18型单一型别感染样本检测结果图； 图6为HPV66型单一型别感染样本检测结果图； 图7为HPV三种型别（16,18,45型）混合感染样本检测结果图。
[0024]
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不 限定本发明。
[0026] 实施例1:本发明试剂盒的组成及主要原材料的厂商和规格 1.运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒组成如下：
其中，连接引物包括上述SEQIDN0 :1~36序列，通用引物包括上述SEQIDN0:37~ 38序列，荧光探针包括上述SEQIDNO: 39~56序列。
[0027] 上述探针1~18的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团，其中，探针1连接的 荧光基团为ffiX，探针2连接的荧光基团为TEXASRED，3~18连接的荧光基团为FAM。
[0028] 上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒中所使用的连接酶系统中，每人份体系 含连接酶1U。
[0029] 上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过 化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs 为 0? 2mmol/L，UDG酶为 0? 3U。
[0030] 上述运用连接酶检测高危型HPV的试剂盒还设有RNA提取液，RNA提取液的组成 成分为EDTA的浓度为0? 001mol/L，Tris的浓度为0? 01mol/L〇
[0031] 2.本发明试剂盒主要原材料的厂商和规格
实施例2 :本发明试剂盒的使用方法 1.样本处理与RNA提取 1) 向宫颈刷保存管中加入2ml灭菌生理盐水(务必使拭子头完全浸入液体中），震荡 60秒(使细胞充分落入液体，灭菌生理盐水变浑浊)，将全部洗涤液转至相应编号的2ml离 心管； 2) 编好号的样品10,OOOrpm离心3分钟，弃上清； 3) 样品沉淀中加入lml灭菌生理盐水，洗涤沉淀，10,OOOrpm离心3分钟，弃上清； 4) 样品沉淀中加入50WRNA提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用； RNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。
[0032] 5)质控品处理 取装有HPV阳性质控品和阴性质控品的离心管，10,OOOrpm离心30秒，然后按（2)~ (4)的提取步骤操作。
[0033] 2.连接试剂准备(试剂准备区，冰上操作） 1)从试剂盒中取出连接反应管，瞬时离心备用； 2)往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸10W(如样本不足10耵，请用灭 菌纯化水补足10W后加样)、提取后的阴性质控品10W及提取后的阳性质控品1〇耵。盖紧 管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
[0034] 3?连接条件（PCR仪上操作） PCR仪设置参数为： 37。。，5min; 65°C，20min。
[0035] 反应条件结束后，取出连接酶反应管(连接产物)置于2-8°C保存(连接产物如需长 期保存，可置于_20±5°C)。
[0036] 4.核酸扩增试剂准备(试剂准备区，冰上操作） 1) 从试剂盒中取出荧光PCR反应管，瞬时离心备用； 2) 往上述反应管中加入连接产物10W(包括连接后的阴性质控品和阳性质控品）。盖 紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
[0037] 5.PCR扩增 PCR仪设置参数为： 50〇C,3min；95〇C,5min； 95°C，5s，55°C，31s，循环 45 次。
[0038] 在55°C时测定荧光值。
[0039] 根据荧光值变化曲线，确定检测结果。
[0040] 质量控制
[0041] 使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进 行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的ct值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒Ct值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒Ct 值小于等于37时，均属于阳性组。因此，将Ct值大于37作为为本试剂盒的参考值（CUTOFF 值)。
[0042] 使用本发明检测试剂盒的检测结果示意图如图4~7所示。从图中可以清楚地看 出，本发明的检测试剂盒可以有效地检测出高危型HPVE6/E7mRNA，检测结果准确可靠。
【主权项】
1. 运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒，所采取的技术方案为： 1) 针对需要检测的每个高危型HPVE6/E7mRNA序列设计相应的连接引物、一对荧光 PCR通用引物及各高危型别的特异性荧光探针，上游连接引物为普通引物，下游连接引物为 5'磷酸化标记， 2) 上下游连接引物与样本提取后的RNA靶片段互补配对，在连接酶的作用下，上下游 连接引物连接成与靶片段完全互补配对的cDNA序列， 3) 将连接后的cDNA序列作为荧光PCR反应的模板，仅一对通用引物即可扩增所有型别 连接后的cDNA序列，检测反应体系的荧光变化，达到对样本高危HPV基因分型检测的目的。2. 根据权利要求1所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，包括连接 反应管、荧光PCR反应管、阴性对照和阳性对照，其中，连接反应管由连接酶系统和连接引 物组成，荧光PCR反应管由热启动Taq酶系统、通用引物及各型别对应的荧光探针组成，荧 光探针为HPV特异性MGB探针， 通用引物的序列如下：3. 根据权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，通用 引物序列的特征表现为：一条与上游连接引物的5'端部分序列完全一致，另一条与下游连 接引物的3'端部分序列互补配对，通用引物的长度在20~30bp。4. 根据权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，HPV 特异性MGB探针的序列如下：上述探针的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团。5. 权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，其连接酶 系统中的连接酶仅能以RNA为模板进行连接反应，且每人份连接体系中连接酶用量为1U。6. 权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，所使用的 热启动Taq酶系统中添加有UDG酶。7. 权利要求1或2所述的运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒，所使用的 热启动Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中 热启动Taq酶为 5U，dNTPs为 0? 2mmol/L，UDG酶为 0? 3U。8. 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒还设有RNA提取液， RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0?OOlmol/L、Tris的浓度为0?Olm〇l/L〇9. 权利要求4所述的HPV特异性MGB探针，探针1连接的荧光基团不同于探针2, 3~ 18连接的荧光基团。10. 权利要求4所述的HPV特异性MGB探针，探针2连接的荧光基团不同于探针1，3~
【专利摘要】本发明涉及一种运用连接酶检测高危型HPV？E6/E7？mRNA的方法及试剂盒。本发明方法的技术要点在于，特异性连接引物在连接酶作用下连接成与HPV？E6/E7？mRNA靶序列互补的cDNA片段，后期的荧光PCR反应体系中的一对通用引物即可扩增成功连接的cDNA片段，即本发明应用单重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种可引起宫颈癌的高危型HPV，有效解决了引物过多导致的扩增效率低下及灵敏度低等问题。且本发明检测HPV？E6、E7？mRNA的目的在于筛查出已经发生HPV感染人群中的高危群体，相对现有的HPV基因组L1区分型检测更具有临床诊断意义。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105112564
【申请号】CN201510553343
【发明人】陈华云, 陈嘉昌, 刘淑园, 肖湘文, 赵丽, 彭俊然, 方凤银, 叶映玲
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月2日