HMB27703液体制剂；用水稀释50倍。 柳巧]似空白对照：清水
[0076] (二）试验方法：本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内 进行。首先将赔石与棉田上壤按照1 :1比例混匀，i2rc高压湿热灭菌1小时，隔天相同条 件再灭菌1次。在500克±壤中接种立枯丝核菌菌丝段悬浮液（约10 7个/毫升）10毫升， 揽拌均匀后装填在直径20厘米的塑料花盆中，压实。棉花品种选用冀丰106,播种前应用实 施例1制备的HMB27703液体制剂50倍水稀释液浸种半小时；W清水浸种半小时作为空白 对照。浸种处理后每盆播种10粒种子，覆盖灭菌±壤，正常培养。出苗后20天调查每棵苗 的发病级别，计算病情指数和防治效果。
[0077] 表2枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯病防效试验结果
[0078]
[0079] 结果（见表2)当空白对照棉花立枯病病情指数为58. 65时，枯草芽抱杆菌 HMB27703浸种处理的病情指数为16. 67,其防治棉花立枯病的效果可达71. 58%。说明本发 明枯草芽抱杆菌HMB27703及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。
[0080] 实施例4枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯病的防治效果试验 阳0川（一）试验处理：
[0082] (1)微生物菌剂：实施例1制备的HMB27703液体制剂；按照1 :1比例添加碳酸巧， 制备HMB27703粉剂。 阳〇8引 似空白对照：清水
[0084](二）试验方法：
[00化]本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。首先将赔石 与棉田±壤按照1:1比例混匀，I2rc高压湿热灭菌1小时，隔天相同条件再灭菌1次。在 500克±壤中接种立枯丝核菌菌丝段悬浮液（约107个/毫升）10毫升，揽拌均匀后装填在 直径20厘米的塑料花盆中，压实。棉花品种选用冀丰106,播种前应用实施例1制备的按照 1 :1比例添加碳酸巧，制备HMB27703粉剂；按照药种比1 :10拌种处理棉花种子，W未处理 种子作为空白对照。处理后每盆播种10粒种子，覆盖灭菌±壤，正常培养。出苗后20天调 查每棵苗的发病级别，计算病情指数和防治效果。
[0086] 表3枯草芽抱杆菌HMB27703对棉花立枯病防效试验结果
[0087]
[0088] 结果(见表3)1当空白对照棉花i枯病病ti指数为：^2. 69时，枯草芽抱杆菌 HMB27703拌种处理的病情指数为5. 26,其防治棉花立枯病的效果为83. 90%。说明本发明 枯草芽抱杆菌HMB27703及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。
[0089] 实施例5枯草芽抱杆菌HMB27703对=种重要病害病原菌的抑制作用试验
[0090] (一）试验时间和地点：2015年5月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病 害生物防治实验室内进行。 阳0川（二）试验方法：
[0092] (1)供试病害病原真菌来源：棉花黄萎菌WX-1分离自河北省邢台市威县棉花黄 萎病病株，棉花枯萎菌F0V-1分离自河北省耶W市曲周县棉花枯萎病病株，番茄灰霉菌 BC-1分离自河北省保定市徐水县番茄灰霉病病果，经河北农业大学植物保护学院植物病理 系鉴定分别为大丽轮枝菌（Verticilliumd址aliae)、尖抱镶刀菌棉花专化型（化sarium 0巧poriumf.sp.vasinfectum)和灰葡萄抱菌度otiytiscinerea)，致病力测定均表现为 强致病力。
[0093] (2)平板测定试验：
[0094] 首先将供试的病原真菌在PDA平板上活化，培养3-7天后在菌落边缘区域，用打孔 器（0=6mm)打孔制成菌片，将供试病原真菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施 例1步骤（1)活化的枯草芽抱杆菌HMB27703点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对 照（不点接HMB27703菌株的供试病原真菌的生长情况）。25°C恒溫培养3-7天，逐日观察 HMB27703菌株和供试病原真菌的生长情况，待对照病原菌长至培养皿边缘时，观察并记录 对照病原菌生长的半径，抑菌带宽度。用"+++"表示HMB27703菌株抑菌作用很强，抑菌带宽 度大于9. 0mm;用"++"表示HMB27703菌株抑菌作用为中等强度，抑菌带宽度为3. 0-9. 0mm; 用"+ "表示HMB27703菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽度小于3. 0mm。 阳0巧]表4HMB27703菌株对=种重要病原真菌的抑制作用
[0096]
[0097] 结果（见表4)枯草芽抱杆菌HMB27703对番茄灰霉菌具有很强的抑制作用，对 枯萎菌也具有中等强度的抑制作用，对棉花黄萎菌的抑制作用较弱。说明枯草芽抱杆菌 HMB27703具有防治番茄灰霉病和棉花枯萎病的生防潜力。
【主权项】
1. 一种枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)菌株HMB27703,己于2015年9月29日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 11458。2. 利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703生产的微生物菌剂，其特征在于其活 性成分为枯草芽孢杆菌HMB27703菌体。3. 按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂或粉 剂。4. 权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将低温保存的HMB27703菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养 基上，在25~35°C下培养10~16小时，得活化的菌株； (2) 用无菌的接种环刮取一环步骤（1)活化的菌株接种到IOOmLLB液体培养基中，在 25~35°C、摇床转速为150~220rpm条件下培养10~16小时，得种子液； (3) 按照体积比为1~3%的比例将步骤（2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基中， 在温度为25~35°C、摇床转速为150~220rpm条件下发酵培养40~50h，得发酵液； (4) 检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90% 时停止发酵培养；所得即为HMB27703菌株的液体制剂。5. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤（1)中所述的LB平板培养基 或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钠 4~6g，琼脂粉12~18g，水1000 mL;其步骤⑵中所述的LB液体培养基的组成成分及其 重量比为：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钠4~6g，水1000mL。6. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤（3)中所述的玉米粉黄豆粉培 养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0~3.0%，黄豆粉1.0~3. 0%，NaCl0. 1~ 0? 8%，MnS04 ?H2O0? 5~L0%，其余为水；pH值为 7. 0。7. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯 萎病上的应用。8. 权利要求2所述的微生物菌剂在防治棉花立枯病、番茄灰霉病或棉花枯萎病上的应 用。9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，其特征在于以待测菌株 的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB27703菌株的鉴定方法，其特征在于以待测菌 株的基因组DNA为模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物 为SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，即为HMB27703菌株。
【专利摘要】本发明属于农业生物防治领域；公开了一种用于防治棉花立枯病的枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)菌株HMB27703，其保藏编号为CGMCC？No.11458。本发明还公开了利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治棉花立枯病上的应用。本发明枯草芽孢杆菌HMB27703对棉花立枯病的药效高，平均防效在80.0％以上；其次，杀菌谱广，除了棉花立枯病外，还对番茄灰霉病和棉花枯萎病有明显的防治效果；此外，本发明枯草芽孢杆菌针对性强，持效期长，且不易产生抗药性；本发明微生物菌剂对人、畜安全，环境污染小；本发明制备方法简单、成本低、使用简单。CGMCC No. 1145820150929
【IPC分类】A01N63/02, C12N1/20, A01P3/00, C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/125
【公开号】CN105199997
【申请号】CN201510738626
【发明人】李社增, 鹿秀云, 马平, 郭庆港, 张晓云, 王莹
【申请人】河北省农林科学院植物保护研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月3日