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[0151] (3化.coliEPI300电转感受态高效制备方法
[0152] 1)挑EPI300单菌落接入SOB液体试管中，37°C过夜培养；
[0153]。转接200ill菌液至含有200mlSOB的500ml摇瓶中（一次3个），37度培养 2-3h，至孤550 = 0. 5 ;
[0154] 3)离必收集菌体，10 %甘油洗涂2-3次，最后重悬至0D550 = 200-250,大约 400y1/每200血菌液；
[01巧]4)分装30y1/管，保存于-8(TC。
[0156] 本发明的主要优点在于：
[0157]本发明采用了改进了Gibson组装方法，使组装效率从0提升至20-30 %，从而建立 了一种适用于高GC含量DNA大片段的组装方法；同时，由于使用了通用的载体与片段间的 重叠区片段，所W不再像原有Gibson组装方法，需要每一步扩增载体，即每次组装时均可 采用相同载体，极大地提高了重组效率。
[0158] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0159] 菌株、质粒与试剂：
[0160] 本发明涉及始旋链霉菌Streptomycespristinaespiralis肥CB10218,于 2011 年 11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中必（CGMCC)，保藏号CGMCC NO. 5486。E.coliEPI300 (用于大片段体内拼接）购自Epicentre公司。E.coliS17-1 (用 于接合转移）购自BiomedalLifeScience公司。
[0161] 本发明中pSET152与pKCl139均购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中必）。 pCClBAC购自于Elpicentre公司。
[0162] 本发明中使用的DNA胶回收纯化W及质粒提取试剂盒购自Axygen公司， E,Z，E沒,游'BAC/PACDNAKit购自OmegaBio-Tek公司。限制性内切酶NdeI，MleI，Sph I与MluI购自化rmentas公司（用于图3B中酶切鉴定）；Taq连接酶与化usionDNA聚合 酶购自肥B公司，巧核酸外切酶与CopyControl?InductionSolution购自Epicentre公 司。其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装。
[0163] 培养基：
[0164] 1.液体LB培养基（1L)
[0165] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、蒸傭水1L;12rC灭菌20分钟。
[0166] 2.固体LB培养基（1L)
[0167] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、琼脂粉20g、蒸傭水1L;12rC灭菌20分钟。
[016引 3.液体SOB培养基（1L)
[0169] 蛋白腺20g、酵母粉5g、氯化钢0. 5g、氯化钟0. 186g、蒸傭水1L、用氨氧化钢调节 抑至7. 0 ;12TC灭菌20分钟。
[0170] 4.液体S0C培养基
[017。 液体SOB培养基添加20mM葡萄糖；12rC灭菌20分钟。
[0172] 5.液体RP培养基配方（1L)
[0173] 可溶性淀粉lOg、葡萄糖lOg、黄豆粉15g、酵母粉5g、KN032. 5g、化Cllg、CaC〇34g; 蒸傭水IL。调抑7. 0~7. 2,12rC灭菌20分钟。
[0174] 6.固体RP培养基配方（1L)
[0175] 可溶性淀粉 20g、黄豆饼粉lOg、化C12g、KH2PO4O. 5g、M拆〇4. 7H2〇lg、CaC〇33g、琼脂 粉20g、蒸傭水1L;调P册.4,12rC灭菌20分钟。
[0176] 7.始旋链霉菌种子培养基（1L)
[0177] 可溶性淀粉lOg，葡萄糖lOg，黄豆粉15g，酵母粉5g，KN032. 5g，化Cllg，CaC〇34g。 先将淀粉用热水糊化，加入其它原料，定容，调pH7. 0~7. 2,最后加入碳酸巧，揽拌均匀，分 装灭菌。
[0178] 8.始旋链霉菌发酵培养基（1L)
[0179] 可溶性淀粉lOg，葡萄糖15g，黄豆粉25g，酵母粉3. 5g，棉巧蛋白粉5gKH2P〇4〇. 1邑， M拆〇4?7H2〇2g，。先将淀粉用热水糊化，再加入其它原料，定容，调P册.0,然后加入碳酸巧 6邑，揽拌均匀，分装灭菌。
[0180] 实施例1
[0181] 改进的Gibson组装方法与原有方法组装效率对比
[0182] 前期，采用Gibson等温一步法直接组装来自于原始霉素II生物合成基因簇中的 3个片段（F7-F9,尺度均大约5化，其中，各片段的GC含量均大于70%)，载体基本全部自 连，组装效率为0。更换其他一组3个片段（F10-F12,尺度均大约5化，各片段的GC含量为 均大于70 %)进行组装，结果类似（图2)。该实验结果提示，高GC含量重叠区（GC含量约 75% )导致如此低的组装效率。
[0183] 于是本发明人对原有方法进行了如下改进（图1):
[0184] 1)针对链霉菌基因组高GC含量的特点，此次设计主要在载体pCClBAC或片段两侧 添加2化P富含A或者AG的接头（序列如SEQIDNO. : 1和2所示），W降低载体自连频率， 提高组装效率，其中序列如下：
[0185]SEQIDNO. :1:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT;
[0186]SEQIDNO. :2:TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC。
[0187] 2)由于使用了相同的载体与片段间重叠区，所W不再像原有Gibson组装方法，需 要每一步扩增载体，即每次组装时均可采用相同载体；
[0188] 3)重叠区两侧设计了两个相互交错的限制性内切酶酶切位点（NdeI和化eI)，W 获得上一级的组装产物，实现等级化拼接。
[0189] 本发明人采用改进方法，对上述两组片段（从5化至15化）进行了组装，结果如表 1所示；组装效率从原有的0提升至30%。在下一级组装过程中（从15化至45化），效率 为20%。每一次组装结果均随机挑选20个转化子进行鉴定，两次生物学重复。
[0190] 表1组装效率结果的总结
[0191]
[0192] 其中，本实施例1和实施例2中所采用的各拼接元件的GC含量如表2所示。
[0193] 表2拼接元件的GC含量
[0194]
[0195]
[0196] 实施例2
[0197] 改进的组装方法用于拼接原始霉素II生物合成基因簇
[0198] 利用改进的Gibson组装方法，对始旋链霉菌原始霉素II生物合成基因簇进行 了体外拼接。组装等级化模式如图3,其组装过程分为3级。其中出发片段F1-F14来源 于基因簇本身（来源于始旋链霉菌工业菌肥CB10218)，而片段F15来源于载体PSET152， 主要包含接合转移相关元件（整合酶地iC31、整合位点attP、穿梭元件or口与阿普霉素 抗性基因）。按照实施例1中介绍的组装方法，成功获得了原始霉素II生物合成基因簇 (PCC1BAC-F1F15)，采用四种酶进行鉴定，结果与预期一致。
[0199] 最后，本发明人对其全长进行了测序，与预测的序列相符。送表明，采用本发明的 拼接方法，可高效拼接获得完整的原始霉素II生物合成基因簇。
[0200] 实施例3
[0201] PII生物合成基因簇体外组装产物的功能互补
[0202] 1. 1PII合成基因簇主要部分巧4化/67化）的敲除
[0203] 为验证获得的Pn生物合成基因簇的体外组装产物度AC-F1F15)是否具有生理功 能，在本实验中，敲除了pn合成基因簇主要部分（基因簇呈离散分布，一段大小为13化，另 一段大小为54化，此次敲除了54化的主要片段）。敲除方法采用地C1139介导的同源重组 策略，同时借助了I-scel归巢内切酶。该酶可W在同源重组时促进DNA单链缺口的产生， 提高双交换效率。成功获得了PII合成基因簇主要部分的缺失突变株10218 A PII，PCR验 证结果未显7JK。
[0204] 发酵结果如图3所示：原始霉素I与II均不再合成，说明原始霉素II组分合成基 因簇成功敲除，并且敲除对原始霉素I的合成也有影响。
[0205] 1. 2PII生物合成基因簇体外拼接产物导入10218 A PII
[0206] 将实施例2中含有组装并经修复的PII生物合成基因簇体外组装片段重组质 粒pCClBAC-FlF15(实施例2中构建）首先转化入大肠杆菌S17-U购自BiomedalLife Science公司），然后通过接合转移导入步骤1. 1中制备的缺失突变株10218APII。W空载 体导入10218APII作为阳性及阴性对照。
[0207] 最终获得2株重组菌株，分别是互补菌株10218APII/BAC