一种生物活性多肽 delqdkih 及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及蛋白领域，具体设及一种生物活性多肤DELQDKIH及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 由于生物活性肤作为促进健康的生物活性成分，具有传递生理信息，调节生理功 能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维 持非常重要。它们不仅具有抗病毒、细菌、抗高血压、降胆固醇等作用，而且作为免疫调节剂 具有调节免疫反应、抗肿瘤等功能；能够清除自由基具有延缓衰老的功效，是当前国际食品 界最热口的研究课题和极具发展前景的功能因子。各种活性肤常作为功能食品添加成分用 于食品的实践生产，特别是在乳饮料、食品添加剂的应用方面已经取得良好效果。乳源性生 物活性肤的功能及对消费者的健康的影响正备受重视。
[0003] 近年来，越来越多的科学研究表明很多来源于生物蛋白的小肤具有多种生物学活 性，如激素作用、免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同时， 研究发现小肤可W被人体更好地吸收和利用，改变了传统的蛋白质只能被降解成氨基酸才 能被吸收利用的观点。在众多生物蛋白中各种牛乳蛋白是非常重要的生物活性多肤来源之 一，它们被乳酸菌分解利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肤或者游离的 氨基酸，最终被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环， 发挥其生物活性作用。
[0004] 因此，运些生物活性小肤不仅成为筛选药物的天然资源宝库，也是功能性食品工 业的主要原料成分。目前，生物活性肤的制备及其应用开发已经成为世界范围内研究的热 点。
[0005] 免疫活性肤是继阿片肤发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生 物活性肤。1981年，化lies等人首次发现，利用膜蛋白酶水解人乳蛋白，从水解物中 得到一种免疫活性肤段，其氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，该短肤被证明在 体外实验中能够增强小鼠腹腔巨隧细胞对绵羊血红细胞的吞隧作用，静脉注射，则能 增强小鼠对肺炎克氏杆感染的抵抗能力。Elitsur等人经胃蛋白酶处理酪蛋白得到 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu和Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu，研究证明该两短肤不仅具 有阿片样活性，也具有免疫调节活性，可增强淋己细胞增殖，提高自然杀伤细胞（NK)能力， 促进隧中性白细胞的移动。张少辉等人利用瑞±乳杆菌发酵脱脂乳获得了生物活性多肤 犯P化及其降解产物犯PV，经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肤犯PV 具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性，一方面能够清除机体内的自由基， 减少自由基对人体的伤害；另一方面，生物活性多肤犯WL和犯PV还能够增强机体免疫力， 增强淋己细胞、巨隧细胞的增殖能力，使巨隧细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨隧细胞分泌 细胞因子。
[0006] 尽管牛乳蛋白内隐含有许多具有生物活性的肤序列，但运些生物活性肤序列只有 通过一定的手段将其释放出来才能发挥作用。获取乳蛋白源活性肤的主要手段有两种：发 酵，利用微生物（乳酸菌）发酵乳源蛋白获取；酶解，包括来自动物的消化道酶和来自植物 和微生物的蛋白酶。
[0007] 研究结果表明乳源性生物活性肤作为一类小分子物质，W其分子量低、活性强、用 量少的独特优势，已越来越多的引起人们的重视。所W它们不仅仅作为功能性食品原料用 于各种功能性食品的制造，而且作为免疫调节剂具有调节免疫反应、抗肿瘤等功能；能够清 除自由基具有延缓衰老的功效。此外，多数乳源性生物活性肤能够抵抗胃肠道的消化，在小 肠内W完整的形式被机体吸收，而不必被分解成单个氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性 极高。因此乳源性生物活性肤的能够提高机体抵御外界不良因素的刺激、降低机体发病率 等功能特性备受重视，有望成为具有清除自由基、减少患癌几率和延缓衰老的非药物性物 质原料，在功能性食品和医药领域具有非常广阔的应用前景，今后必将成为国际食品界和 生物医药产业界的最热口的研究课题，为提高人类健康水平、不得病或者说少得病、延缓衰 老、延长寿命发挥重要的作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种分离的生物活性多肤DELQDKIH及其制备与应用。
[0009] 为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 本发明的第一方面，提供了一种分离的生物活性多肤DELQDKIH，其包括
[0011] (a)由Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His(SEQIDNO:1)所示的氨基酸组成的 多肤；
[0012] 化）或在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有同等活性的由（a)衍生的多肤。
[0013] 较优的，所述生物活性多肤的来源为乳源性。
[0014] 本发明的生物活性多肤呢LQDKIH为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为 β-酪蛋白（SEQIDNO: 2)第43~50位的氨基酸残基。
[0015] 所述β-酪蛋白的氨基酸序列为既有技术，β-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编 号为AAA30431. 1，具体序列如沈QIDNO:2所示：
[0017] 较优的，所述生物活性多肤DELQDKI具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功 能。
[0018] 本发明的生物活性多肤DELQDKIH可W通过基因工程的方法和化学方法人工合 成，也可W从乳制品中通过分离纯化、酶降解的方法获得。
[0019] 本发明还公开了编码前述生物活性多肤DELQDKIH的核巧酸片段。
[0020] β-酪蛋白的氨基酸序列W及核巧酸序列为既有技术，编码β-酪蛋白（SEQ ID NO:2)第43~50位的氨基酸残基的核巧酸片段能编码成熟的生物活性多肤DELQDKIH。
[0021] 本发明的第二方面，提供了前述生物活性多肤的制备方法，包括如下步骤：
[002引 1)发酵：将瑞±乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞±乳杆菌发酵乳；
[002引。破壁：对发酵乳离屯、后得到的菌体进行超声，破碎菌壁使胞内肤游离，获得菌 肤混合液；
[0024] 3)多肤的粗提：对步骤2)中的菌肤混合液进行低溫离屯、分离，取上清液；
[00幼 4)多肤的纯化：
[0026] a.对步骤3)的上清液进行超滤处理，收集滤液；
[0027] b.固相萃取柱分离：收集的滤液采用Waters S巧-pak C18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多肤混合物；
[0028] 5)多肤的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤4)的生物活性多肤混合物，获 得被消化后的生物活性多肤混合物；第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采 用的酶为膜酶。
[0029] 本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0030] 较优的，步骤1)中，瑞：t乳杆菌为瑞：t乳杆菌（Xactobacillus helveticus,CICC6024)〇
[0031] 较优的，步骤1)中，所述厌氧发酵的条件为：发酵溫度36~38°C，发酵培养6~ 她；更优选发酵溫度37°C，发酵培养化。
[0032] 较优的，步骤2)所述离屯、的条件为：20°C，4000~5000;rpm，离屯、15min.。
[0033] 较优的，步骤2)所述破壁的条件为菌体浓度0. 0238g/ml，破碎功率300W，破碎总 时间26min(超声3s,间隔5s)。
[0034] 较优的，步骤3)中，所述低溫离屯、的条件为：4°C，8000~10000巧m，离屯、15~ 30min〇
[0035] 较优的，步骤4) a中，所述超滤处理所采用的是截留分子量分别为3kDa的超滤管。
[0036] 更优的，步骤4)a中，所述超滤处理过程中，转速