一种检测肝吸虫的特异性抗原CsSP46、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种检测肝吸虫的特异性抗原CsSP46、 其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 目前，肝吸虫病主要分布在亚洲，我国23个省市区均有本病流行，本病的流行与 传染源的多寡、河流坑塘的分布、粪便污染水源的情况、当地的气候W及当地居民饮食习惯 等诸多因素密切相关。肝吸虫病的感染无男女老少之分，人群普遍易感，其在一个地区流行 的关键因素是当地人群有生吃鱼肉或吃未煮熟的鱼肉的习惯，如广东珠江Ξ角洲一带、香 港、广西、台湾、黑龙江和迂宁的朝鲜族居住地区。
[0003] 肝吸虫病的临床表现常为慢性过程，感染后逐渐发生症状、体征。多数人为轻度感 染无明显症状，一般病例可有食欲不振、乏力、消化不良、肝区疼痛、腹胀、腹泻等消化道症 状W及轻度浮肿、肝脏肿大等。儿童和青少年感染肝吸虫病后，临床表现较为严重，除上述 症状外，还可影响生长发育，甚至死亡。肝吸虫病的主要并发症有胆管炎、胆囊炎、胆管肝 炎、胆石症、膜腺炎和肝硬化等，甚至可并发胆管癌等，严重影响人体健康。成虫主要寄生在 人、犬、猫、猪等的肝胆管内，成虫浸出物及代谢产物中含有抗原成分，感染人体后会诱发多 种免疫病理反应，在肝吸虫病人血清中，IgG是最容易检测到的特异性抗体，宿主感染肝吸 虫后可诱发较强的体液免疫应答，参与体液免疫的主要免疫球蛋白为IgG，其水平与感染度 呈正相关，也就是说肝吸虫IgG抗体水平在一定程度上可反映病人感染程度。在肝吸虫病 的诊断及流行病学研究等方面具有重要意义，可辅助诊断肝吸虫感染及筛查感染人群。而 IgG4是肝吸虫感染及治疗评价更为特异的指标。
[0004] 传统上，用患者粪便中肝吸虫虫卵的病原学方法检测肝吸虫病；近年来，免疫检 测的方法逐渐被用于肝吸虫病的临床诊断研究中来，并取得了良好的效果。目前实验室和 临床应用的免疫学诊断方法主要有皮内试验（ID)、间接血凝试验（IHA)、免疫酶染色试验 (IEST)、酶联免疫吸附试验巧LISA)、间接巧光抗体试验（IFAT)、酶联免疫印溃技术巧LIB) 等。
[0005] 随着我国对肝吸虫全基因组测序的完成，其全部基因组序列和编码的可能的 蛋白质序列都已被解析，为肝吸虫诊断试剂的开发奠定了基础，肝吸虫基因组学研究为 我们提供了大量有价值的基因组信息，增加了我们对肝吸虫生物学知识。肝吸虫所有 的基因组鸟枪法测序和转录组数据已全部释放，可WNCBI序列阅读文本的形式从网上 获取GenBank中[SRA:029284和035384]，鸟枪片段组装序列和基因模型都可W开放 访问。运些基因组序列可W从日本DNA数据库Q)DBJ:BADR01000001-BADR01060778(C ontigs)和DF126616-DF142827(scaffolds)]中下载，也可W从NCBI[NCBI:72781]和 GenBank[GenBank:BADR00000000. 1]数据库中下载。
[0006]CN103459414A公开了一种对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，更具体地，提供 一种生成对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质，从而在诊断及治疗肝吸虫类时，增加灵敏度 和特异性的抗原蛋白质。国内外研究人员利用分子生物学技术，参照血吸虫诊断抗原，克 隆表达了肝吸虫多个免疫诊断侯选抗原，评价了其在免疫诊断中的效果。其中包括谷脫巧 肤琉基转移酶、半脫氨酸蛋白酶、组织蛋白酶^天冬氨酸蛋白酶D、7kDa抗原、卵蛋白，成 孔肤、表膜蛋白等。运些抗原并非肝吸虫所特有的基因，其他寄生虫和宿主也有相似的基 因。因此，使用运些重组抗原检测肝吸虫病人的血清中的IgG4,敏感性和特异性都不令人 满意，与其他寄生虫交叉反应比较严重。
【发明内容】
[0007] 本发明为了克服上述诊断抗原的缺陷，在诊断抗原的选择上提供一种检测肝吸虫 的特异性抗原CSSP46、其制备方法及应用，能够对肝吸虫的防治及检测提供新的免疫诊断 技术。
[0008] 为达到此发明的目的，本发明采用W下技术方案：
[0009] 第一方面，本发明提供了一种检测肝吸虫的特异性抗原CsSP46,所述特异性抗原 CsSP46的氨基酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段，所述片段的序列如下：
[0011] 本发明中，通过肝吸虫现有基因数据库，发掘了一个特有的经非经典途径分泌的 碱性蛋白CsSP46,通过基因工程手段从肝吸虫的基因序列中获得，作为一种特异性抗原，可 作为肝吸虫病检测的特异性包被抗原，相比于直接用从感染肝吸虫病人血清中纯化的肝吸 虫抗原，专一性更强，效果更好；本发明首选肝吸虫所特有的抗原性指数高的分泌抗原，W 提高其诊断的特异性和敏感性。
[0012] 优选地，所述特异性抗原CsSP46含有413个氨基酸。
[001引优选地，所述特异性抗原CsSP46的基因序列包含如SEQIDNO. 2所示的片段，所 述片段的序列如下：
[001引优选地，所述特异性抗原CsSP46的基因序列的PCR扩增引物为：
[0016] 上游引物如沈QIDNO. 3所示，下游引物如沈QIDNO. 4所示。
[0017] 上游引物：5,-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3'（沈QIDNO. 3)，
[0018]下游引物：5'-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3'（沈QIDNO. 4)。
[0019] 第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的特异性抗原CsSP46的制备方法，其 特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0020] (1)通过PCR扩增技术获得所述CsSP46的基因序列，并将CsSP46的基因序列重组 到表达载体中，构建重组载体；
[0021] 似将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述CsSP46基因序列的阳性转化菌；
[0022] (3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述 CsSP46基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述CsSP46蛋白表达；
[0023] (4)亲和层析纯化所述CsSP46蛋白。
[0024] 优选地，所述PCR扩增的引物为：
[00巧]上游引物如沈QIDNO. 3所示，下游引物如沈QIDNO. 4所示。
[0026]上游引物：5,-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3'（沈QIDNO. 3)，
[0027]下游引物：5'-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3'（沈QIDNO. 4)。
[0028] 优选地，所述PCR扩增的退火溫度为58°C。
[002引在本发明中，通过PCR扩增获得特异性抗原CsSP46基因序列，所述的基因序列如 下：
GGAACGCACAATCATCAAAGACTCCCAAGTAAo
[0031] 第Ξ方面，一种如第一方面所述的特异性抗原CsSP46在制备抗肝吸虫的药物和/ 或试剂中的应用。
[0032] 第四方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任一 项所述的特异性抗原CsSP46。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0034] 本发明通过用肝吸虫特异性抗原CsSP46包被制成的肝吸虫IgG抗体检测的敏感 度、特异性等指标均高于90%，能够满足临床诊断的要求，并且基本不存在交叉反应的情 况，操作上比国家针对肝吸虫病的指定诊断金标准方法更简单快捷，重复性更好，可W在临 床诊断中大力推广。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明构建的祀T-28a(+)-CsSP46的质粒示意图；
[0036] 图2为本发明CsSP46蛋白重组质粒酶切鉴定；
[0037] 其中，M1，M2-标准分子量；1-PCR产物；2-重组质粒双酶切；3-空质粒双酶切；
[0038] 图3为本发明祀T-28a(+) -CsCsSP46在大肠杆菌中的表达产物及其纯化产物；
[0039]其中，M-蛋白marker; 1-未诱导的BL21-pET-28a(+);2-诱导后的BL21-pET-28a(+); 3-未诱导的BL21-pET-28a(+)-CsSP46 ;4-诱导后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46 ;5-诱导后的 BL21-pET-28a(+)-CsSP46超声裂解上清部分;6-诱导后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46超声裂解沉淀部 分;7-重组纯化蛋白。
【具体实施方式】
[0040