helveticus，CICC6024)活化即W2%的量接种到12% (W/V)的灭菌脱脂乳中培养，溫度 37°C，培养时间化，即完成瑞±乳杆菌的活化，连续活化2次，制得发酵乳，作为瑞±乳杆菌 发酵乳发酵剂备用。
[006引取10血已制备的瑞±乳杆菌发酵剂接种到500血已灭菌的12wt%脱脂乳中（接 种率为2v/v% )，37°C发酵7小时后，揽开凝乳后，在4°C条件下保存，得到瑞±乳杆菌发酵 乳。
[0069] 二、生物活性多肤混合物的制得和确认
[0070] 1.实验方法
[00川 1)样品处理
[0072] 将前一步骤制备的瑞±乳杆菌发酵乳装入离屯、管中进行离屯、捜集菌体，离屯、条件 为4000巧m/min，20°C，15min。离屯、后弃上清液，取沉淀物，即为所需要的瑞：t乳杆菌菌体。
[0073]将所获得的菌体W4000、4500、5000;rpm/min，20°C，15min的离屯、条件进行Ξ次梯 度离屯、洗涂，离屯、后弃上清液，取沉淀物。
[0074] 将洗涂后的菌体加去离子水配成浓度为0. 0238g/ml的菌体溶液，后进行超声波 破壁，超声条件为破碎功率300W，破碎总时间26min(超声3s，间隔5s)。
[00巧]将超声后的菌肤混合液进行低溫离屯、，离屯、条件为9000巧m/min，4°C，20min。离屯、 后弃沉淀，取上清液。
[0076] 将上清液分别倒入超滤管中，滤膜的截留分子量为3kDa，超滤过程中，转速为 480化/min,时间为30min，离屯、溫度为4°C。收集瑞±乳杆菌发酵乳的滤液，于-4°C冷冻保 存。
[0077] 将超滤液进行固相萃取，用ImLC18小柱，2mL甲醇活化柱子，ImLd地2〇平衡柱子， 上样样品为2mL的超滤液，最后400μL洗脱液洗脱，其中洗脱液为80:20v/v甲醇/水和 0. 1%v/v的甲酸。
[0078] 将得到的洗脱液氮吹后冻干成干粉，后模拟胃肠道消化实验：首先，采用灭菌去离 子水溶解干粉，在溶液中加入胃蛋白酶（购自Sigma公司），比例是每克样品加入胃蛋白酶 20mg，调节反应液的抑值至2. 0,在37°C恒溫水浴中保溫90min;然后将反应液的抑值调 整至7. 5,加入膜酶（CorolasePP，购自德国AB公司），比例是每克样品加入膜酶40mg，在 37°C恒溫水浴中保溫150min;最后置于95°C水浴中加热5min使酶失活，将反应液冷冻浓缩 干燥，制成干粉，储存于-20°C条件下，备用。
[007引。液质分析[0080] 液相色谱条件：
[00引]仪器：WatersAC卵口YUPLC超高效液相色谱仪
[0082] 色谱柱规格：C甜C18色谱柱
[0083]流速：0. 4mL/min
[0084]溫度：45°C
[0085] 紫外检测波长：220nm
[0086]进样量：5 μ L
[0087] 流动相A液：d地2〇 [008引流动相B液：乙腊溶液
[0089]梯度条件：0min-2. 5min保持 99 %A液，1 %B液；2. 5min-5minB液从 1 % 变 为5%，A液从99%变为95%;5min-10minB液从5%变为10%，A液从95%变为90%; 10min-17min%B液从 10%变为 25%，A液从 90%变为 75% ;17min-22min，B液从 25%变 为 40%，A液从 75%变为 60% ;22min-27min，B液从 40%变为 80%，A液从 60%变为 20%; 27111111-29111111，6液从80%变为100%，4液为0%，保持2111111;31111111-31.5111111，8液从100% 变为5%，A液从0%变为95%;31. 5min-32min，B液从5%变为1%，A液从95%变为99%; 32min-34min，保持 99%A液，1 %B液。
[0090]质谱条件：
[00川离子方式：ES+
[0092]质量范围（m/z) :50-2000
[0093]毛细管电压（Capillary) &V) :3. 0
[0094]采样锥（V) :35. 0
[009引离子源溫度（°C)):105
[0096] 去溶剂溫度（°C):350
[0097] 锥孔气流量化/化）：50. 0
[009引去溶剂气流化/虹）：600. 0
[0099]碰撞能量（eV) :6. 0
[0100]碰撞气流（ml/min) :0. 6 [010。扫描时间（sec) :0. 26 [010引内扫描时间（sec) :0. 02
[0103] 根据上述实验条件，利用Masslynx软件分析，得到瑞±乳杆菌发酵乳消化产物中 多肤物质保留时间和分子量，如表1所示，用Masslynx软件提取多肤的质量色谱提取图、一 级质谱图，见图2和图3。
[0104] 表1瑞±乳杆菌发酵乳消化产物中的多肤核质比
[0105]
[0106]Ξ、生物活性多肤的氨基酸序列确定方法
[0107] 1.实验方法
[010引（1)牛乳来源β-酪蛋白氨基酸序列库的建立
[0109]β-酪蛋白（1097-1103,变体A1-A3，B，C，E，巧氨基酸序列通过ΒΙ0ΡΕΡ捜索得到， 将捜索得到的酪蛋白氨基酸序列建成一个数据库。
[0110] (2)多肤质量的匹对
[0111] 对UPLC-MS分析得到的质量，在牛奶β-酪蛋白氨基酸序列库中进行捜索，得到 相关的多肤序列。该步骤通过JAVA程序和MyS化数据库实现，具体的要求如下：输入由 UPLC-MS得到的质量，输出质量误差在±0.01内的多肤序列、该序列的质量、该序列的具体 蛋白来源。
[0112] (3)多肤序列的验证
[011引将得到的氨基酸序列通过Masslynx软件中的Biolynx验证，将预测得到多肤序列 理论上的二级质谱图与MS/MS得到的实际二级质谱图对比，软件通过二级质谱图中主要的 峰是否匹对成功，给出分值，来确认预测得到的多肤。二级质谱匹对图和预测得到的序列的 az，by断裂情况图见图4和图5。
[0114] 2.实验结果
[0115] 经过验证得到生物活性多肤DELQDKIH为乳源性，具体来源于牛乳β-酪蛋白，为 β-酪蛋白）第43-50位的氨基酸残基，记为SEQIDNO:1。
[0116] 此外，所述生物活性多肤DELQDKIH是经胃肠道模拟消化降解得到，并不是原来存 在于瑞±乳杆菌发酵乳中。它能在消化酶的作用后存在，说明多肤具有稳定性，经胃肠道模 拟消化试验后不易被降解。
[0117] 实施例2生物活性肤的抗氧化活性实验
[0118]采用清除自由基法值PPH·法）和总抗氧化能力法（ABTS法），对实施例1得到的 生物活性多肤的抗氧化活性进行了测试。
[0119] 1、巧PPH·]法测定生物活性肤的体外抗氧化活性
[0120] 1)实验试剂及仪器
[012d 试剂：1, 1-二苯基-2-Ξ硝基苯阱（1, l-Dipheny；L-2-pic;ry化y化az;yl [DPPH·])， 日本Wako公司生产；甲醇，上海国药公司提供；合成实施例1中得到的乳源性生物活性多 肤。
[0122] 主要仪器：Pro200酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国 Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。
[0123] 2)实验方法
[0124] (1)0. lmm〇l/LQ)PPH·]甲醇溶液
[0125] 用分析天平称取19. 72mgQ)PPH·]溶于500mL甲醇溶液中，配制得到的0.Immol/ UDPPH·]甲醇溶液，锡纸避光保存，即配即用。
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