一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种利用鄉氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法，属于基 因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 全球人口的持续增长和发展中国家经济的发展促进了化石能源的开采和使用，导 致了严重的环境污染和气候变化问题。因此，开发环境友好型清洁能源具有重要的意义。
[0003]丙烷是液化石油气中的主要成分之一，具有较高的沸点和燃烧热值，因而容易进 行液化和运输。其燃烧过程充分，可W与现有的内燃机和能源运输系统相兼容。此外，丙烷 可用作制冷剂和喷雾推进剂，替换对臭氧层具有破坏性的氣氯控类化合物，对环境保护亦 有重要的价值。当前，石油化工业是丙烷的主要来源。鉴于丙烷的广泛应用和化石燃料资 源的有限性，实现丙烷的生物合成和可再生具有重要的意义。 阳004] 蓝细菌（蓝藻，切anobacterium)是一种能够在体内合成脂肪控类化合物的原核 微生物。Schirmer等人发现了该细菌体内合成脂肪控的关键性基因：脂肪醒去甲酯加氧酶 (Aldehyde-deformylatingoxygenase,ADO)(Schirmeretal., 2010)。ADO属于非血红素 类铁蛋白超家族酶，可利用氧气将脂肪醒氧化，发生脱幾基反应，并生成甲酸和相应的脂肪 控。该酶的发现为实现丙烷的生物合成提供了可能的途径。 阳0化]Kallio等人利用大肠杆菌的脂肪酸合成系统，通过过表达对下酷ACP具有较高特 异性的硫醋酶，使大肠杆菌得W特异性地合成正下醒，再通过在该菌内同时表达的AD0,最 终将正下醒转化成丙烷，实现了丙烷的生物合成化allio2014)。但是，该代谢途径中脂肪 酸合成系统提供的正下醒有限，制约了丙烷产量的提升。因此，为实现丙烷产量的进一步提 高，应建立一条能为ADO提供充足底物的代谢途径。
[0006] 鄉氨酸代谢途径是大肠杆菌内的一种氨基酸合成途径。通过过表达来自乳酸乳球 菌的2-酬酸脱簇酶基因Kivd,可将鄉氨酸代谢途径的中间产物2-酬异戊酸转化为异下醒 (化OtaAtsumi2008)。体外加醒实验证明，异下醒同样可W被ADO催化生成丙烷。因此， 我们希望W大肠杆菌的鄉氨酸代谢途径为基础，通过基因工程改造，构建出可W大量合成 并累积异下醒的菌株。再在该菌株中过表达ADO基因，催化异下醒生成丙烷，从而建立一条 新的丙烷合成途径。表达该代谢途径的大肠杆菌可为ADO提供充足的异下醒底物，为丙烷 产量的提高奠定基础。
【发明内容】
[0007]为解决W上问题，本发明提供了一种利用鄉氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌， 所采取的技术方案如下：
[0008] 本发明的目的在于提供一种利用鄉氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌，该大肠杆 菌过表达乙酷乳酸合成酶基因、2-酬酸脱簇酶基因、酬酸还原异构酶基因、二径基酸脱水酶 基因和脂肪醒去甲酯加氧酶基因，并敲除多个醒还原酶基因和全局转录因子基因。
[0009] 优选地，所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因，来源于蓝藻（切anobacteria)。
[0010] 优选地，所述乙酷乳酸合成酶基因，为来源于枯草芽抱杆菌的乙酷乳酸合成酶基 因alsS;所述2-酬酸脱簇酶基因，为来源于乳酸乳球菌的2-酬酸脱簇酶基因Kivd;所述 酬酸还原异构酶基因，为来源于大肠杆菌的酬酸还原异构酶基因ilvC;所述二径基酸脱水 酶基因，为来源于大肠杆菌的二径基酸脱水酶基因ilvD;所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因， 为来源于原绿球藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基因PMT1231、集胞藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基 因S110208、聚球藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基因〇计1593或点形念珠藻的脂肪醒去甲酯加 氧酶基因化unR1711。
[0011] 更优选地，所述乙酷乳酸合成酶基因alsS，GeneBank登录号：CAB15618. 2 ;所 述2-酬酸脱簇酶基因Kivd,GeneBank登录号：AAS49166. 1 ;所述酬酸还原异构酶基因 ilvC，GeneBank登录号：NP_418222 ;所述二径基酸脱水酶基因ilvD，GeneBank登录号： YP_026248 ;所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因PMT1231，GeneBank登录号：NP_895059 ;脂肪 醒去甲酯加氧酶基因S110208,GeneBank登录号：NP_442147 ;脂肪醒去甲酯加氧酶基因 O计1593,GeneBank登录号：YP_400610 ;脂肪醒去甲酯加氧酶基因化unR1711，GeneBank登 录号：YP_001865325。
[0012] 优选地，所述多个醒还原酶基因是，基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj浊，基 因eutG，基因yiaY，基因y址K，基因化cO和基因DkgA。
[0013] 优选地，所述全局转录因子基因，为全局转录因子基因化r。
[0014] 优选地，还敲除乳酸脱氨酶基因、延胡索酸还原酶基因、甲酸裂解酶基因。
[0015] 更优选地，所述乳酸脱氨酶基因，为乳酸脱氨酶基因1化A;所述延胡索酸还原酶 基因，为延胡索酸还原酶基因化dABCD;所述甲酸裂解酶基因，为甲酸裂解酶基因pflB。
[0016] 所述任一大肠杆菌在合成脂肪控类燃料中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种所述大肠杆菌的构建方法，该方法的步骤如下：
[0018] 1)将质粒PKD46转化到宿主菌E.COliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；
[0019] 2)分别制备含有乙酷乳酸合成酶基因alsS和2-酬酸脱簇酶基因Kivt酬酸还原 异构酶基因ilvC和二径基酸脱水酶基因ilvDW及脂肪醒去甲酯加氧酶基因的重组质粒， 获得代谢途径构建质粒；
[0020] 3)分别构建醒还原酶基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj浊，基因eutG，基因 ^aY,基因y址K，基因化cO和基因DkgA,W及全局转录因子基因化r的基因替换质粒和标 签替换质粒；
[0021] 4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲 除片段；
[0022] 5)先后向步骤1)所得的携带质粒地D46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除 片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；
[0023] 6)W步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺 失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均W上一次操作获得的重组菌为宿 主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得醒还原酶活性缺失的重组大肠杆菌；
[0024] 7)将步骤6)中醒还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2) 所得的代谢途径构建质粒转化到所得的溶源菌中，获得能够利用鄉氨酸途径合成丙烷的重 组大肠杆菌：
[00巧]优选地，所述构建醒还原酶基因y化D的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物 的核巧酸序列如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 4所示；构建醒还原酶基因a化E的基因替换质 粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 8所示；构建醒还原 酶基因a化P的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 9-SEQ IDNO. 12所示；构建醒还原酶基因yj浊的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧 酸序列如SEQIDNO. 13-SEQIDNO. 16所示；构建醒还原酶基因eutG的基因替换质粒和标 签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 17-SEQIDNO. 20所示；构建醒还原酶基 因yiaY的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 21-SEQID NO. 24所示；构建醒还原酶基因y址K的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸 序列如SEQIDNO. 25-SEQIDNO. 28所示；构建醒还原酶基因化CO的基因替换质粒和标 签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 29-SEQIDNO. 32所示；构建醒还原酶基 因DkgA的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 33-SEQID NO. 36所示；构建醒还原酶基因化r的基因替换质粒和标签替换质粒所用引物的核巧酸序 列如沈QIDNO. 49-沈QIDNO. 52所示。
[00%] 本发明还提供了一种具体应用所述重组大肠杆菌合成丙烷的方法，该方法的具体 的步骤如下：
[0027] 1)将质粒PKD46转化到宿主菌E.COliBW25113中，获得携带质粒的宿主菌；
[0028] 2)分别制备含有乙酷乳酸合成酶基因alsS和2-酬酸脱簇酶基因Kivt酬酸还原 异构酶基因ilvC和二径基酸脱水酶基因ilvDW及脂肪醒去甲酯加氧酶基因的重组质粒， 获得代谢途径构建质粒；
[0029] 3)分别构建醒还原酶基因基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj浊，基因eutG， 基因^aY,基因y址K，基因化CO和基因DkgA,W及乳酸脱氨酶基因1化A，延胡索酸还原酶 基因化dABCD，甲酸裂解酶基因PflB和全局转录因子基因化r的基因替换质粒和标签替换 质粒；
[0030] 4)利用步骤3)所得的基因替换质粒和标签替换质粒制备基因敲除片段和标签敲 除片段；
[0031] 5)先后向步骤1)所得的携带质粒地D46的宿主菌中转化同一个基因的基因敲除 片段和标签敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；
[0032] 6)W步骤5)所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5)的操作，获得缺 失两个基因的重组菌，再重复步骤5)的操作，每次操作均W上一次操作获得的重组菌为宿 主菌，直至将步骤3)所述基因全部敲除，获得缺失13个基因的重组大肠杆菌；
[0033] 7)将步骤6)中醒还原酶活性缺失的重组大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤2) 所得的代谢途径构建质粒转化到所得的溶源菌中，获得能够利用鄉氨酸途径合成丙烷的重 组大肠杆菌。
[0034] 8)利用步骤7)所得的重组大肠杆菌发酵合成丙烷。
[0035] 发明人