一种新的二萜类化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从天葵的干燥块根中分离得到的一种具有治 疗黑色素瘤作用的二萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 天葵（Semiaguilegiaadoxoides)为毛茛科植物，属天葵被子植物门，高15~40 厘米，块根灰黑色，略呈纺锤形或椭圆形，生于海拔100-1050米间的疏林下、路旁或山谷地 的较阴处，3-4月开花，4-5月结果。在中国分布于四川、贵州、广西北部、江西、江苏、安徽 等地，在日本也有分布。其根入药称为天葵子，为《中国药典》收载的中药品种，味甘、苦，性 寒，有小毒，有清热解毒、消肿止痛、利尿等作用，治乳腺炎、扁桃体炎、痈肿、瘰疬、小便不利 等症；全草又作土农药。
[0003] 天葵中含有多种化学成分，牛峰等人用HPLC方法对天葵中的化学成分做了指纹 图谱；目前从天葵中分离出的主要成分有生物碱、内酯类、氰苷硝基类、酚类、二萜、木脂素 等成分。目前从天葵中分离得到4个生物碱类成分，分别为异喹啉季铵型和原小檗碱类生 物碱。
[0004] 现代药理实验表明，天葵具有良好的抗肿瘤作用。牛锋采用MTT法对天葵子部分 化学成分的细胞毒活性进行实验，结果表明天葵子素A对于宫颈癌、胃癌和乳腺癌三个肿 瘤细胞株的细胞毒活性都要优于紫杉醇，且对白血病和肝癌肿瘤细胞株也有明显的细胞毒 活性；蓝华英的研究表明天葵中的2_(β -Dgluoopyranosyloxy)-4_hydroxy-benzeneaeet onitrile具有抗肿瘤活性，其ID5。为9. 43 μg/mL ;关频对天葵中生物碱成分的抗肿瘤活性 进行了研究，其中的唐松草酚定在高剂量组（l〇〇〇mg/kg)有较好的抗肿瘤作用，抑瘤率为 37. 1% ;另外S. P. Duan研究显示天葵乙醇提取物对人肝癌Η印G-2和SMMC-7721细胞具有 抑制作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从天葵的干燥块根中分离得到的一种具有治疗黑色素 瘤作用的二萜类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0008]
[0009] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将天葵的干燥块根粉 碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗 脱12个柱体积，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正 相硅胶分离，依次用体积比为80:1、55:1、35:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0010] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80 %。
[0012] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的 载体。
[0013] 所述的化合物（I)在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物（I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较；
[0020] 图3为BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022] 实施例1 :化合物（I)分离制备及结构确证
[0023] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 制备方法：（a)天葵的干燥块根（10kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（25LX3 次），合并提取液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次）和 水饱和的正丁醇（6LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（355g)和正丁 醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用15%乙醇（8L) 和75% (12L)乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（154g); (c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1 (8个柱体积）、 55:1 (8个柱体积）、35:U6个柱体积）、10:1 (8个柱体积）和1:1 (5个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4 (46g)用正相硅胶进一步分离，依次 用体积比为15:1 (8个柱体积）、10:1 (10个柱体积）和5:1 (6个柱体积）的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (27g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分 离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减 压浓缩得到纯的化合物（I) (35mg)。
[0025] 结构确证：HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z393. 1014,结合核磁特征可得分子式 为C2QH1S07,不饱和度为 12。核磁共振氢谱数据δΗ(ΡΡπι，DMS0-d6,500MHz) :H-1(5.81，m)， H-2 (5· 82,m)，H-3 (2· 12,m)，H-3 (2· 38,ddd，J= 15. 0,6· 0,4· 0)，H-4 (2· 94,dd，J= 12. 0， 6. 0)，H-6 (2. 71，dt，J= 14. 0,4. 0)，H-6 (1. 52,dddd，J= 14. 0,14. 0,4. 0, 2. 0)，H-7 (1. 83， ddd，J= 13. 5,13. 5,4. 0)，H-7 (2. 17,m)，H-12 (6. 79,s)，H-14 (6. 52,dd，J= 1. 5,0· 5)， H-15 (7. 27,t，J= 1. 5)，H-16 (7. 29,br，d，J= 0· 5)，H-19 (4. 23,d，J= 8. 5)，H-19 (4. 38， dd，J= 8.5,2.0)，H-20(1.21，s);核磁共振碳谱数据Sc(ppm，DMS0-d6，125MHz) :130.8(CH， 1-C)，131. 1 (CH，2-C)，21· 7(CH2,3-C)，41· 0 (CH，4-C)，46· 8(C，5-C)，21· 4(CH2,6-C)， 25. 3 (CH2, 7-C)，104. 7 (C，8-C)，57. 2 (C，9-C)，99. 8 (C，10-C)，212. 1 (C，11-C)，73. 9 (CH， 12-C)，128. 1 (C，13-C)，109. 4 (CH，14-C)，143. 3 (CH，15-C)，140. 2 (CH，16-C)，172. 5 (C， 17-C)，177. 5(C，18-C)，73. 1(CH2，19-C)，18. 7(CH3,20-C);碳原子标记参见图 1。IR光谱表 明该化合物含有羟基（3491cm3，γ-和δ-内酯（1769和1723cm3以及呋喃环（875cm3 基团。13CNMR谱显示有20个信号，含有一个甲基，四个亚甲基（一个含氧），八个次甲基（五 个烯烃碳，一个含氧碳）和八个季碳（三个羰基碳，一个烯烃碳，两个含氧碳）。 13CNMR谱显 示乙烯基碳信号SC130. 8和131. 1，表明该化合物含有双键。HMBC谱中，Η-1(δΗ5. 81，m) 和Η-2(δΗ5. 82，m)与C-3(SC21.7)和C-4(SC41.0)的相关性，以及H-1与H-2的交叉峰 证实了双键位于C-1和C-2位。核磁数据表明该化合物含有氧杂环丁烷结构（δC104. 7， C-8 ;57· 2，C_9 和δC99. 8，C_10)，甲基（δHI. 21，s;δC18. 7，CH3_20)和呋喃环（δΗ6· 52， dd，J= 1· 5,0· 5Ηζ，Η-14 ;δΗ7· 27,t，J= 1· 5Ηζ，Η-15 ;δΗ7· 29，br，d，J= 0· 5Ηζ，Η-16)。 根据HMBC谱中Η-12 (δΗ6· 79,s)与C-13 (δC128. 1)，C-14 (δC109. 4)和C-16 (δC140. 2) 的相关性，可推断呋喃环位于C-12(δC73. 9)位上。NOESY谱中Η-16与Η3-20(δHI. 21， s)的相关性表明呋喃环为α构型。此外，该化合物还含有一个12, 17-δ-内酯（δH6. 79， s，δC73. 9,CH-12 ;δC172. 5,C-17)和一个 18, 19-γ-内酯（δC177. 5,C-18 ;δΗ4· 23,d， J= 8· 5Ηζ，4· 38,dd，J= 8· 5,2·0Hz，δC73. 1，CH2-19)。NOESY谱中Η3-20 与H-19pr。^口 H_19pros，以及H-19pra5和H-4的相关性表明γ-内酯为反式稠合。综合氢谱、碳谱、HMBC谱 和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型 进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0027] -、材料和仪器
[0028] 人A375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物（I)自制，制备方法见 实施例1，HPLC归一化纯度大于98%。DMEM培养基、0. 25%胰酶购自美国6让〇〇公司。 MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝）、DMS0 (二甲基亚 砜）、BrdU购自美国Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠 二抗购自美国Cellsignaling公司。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国 Promega公司。
[0029] 恒温C02培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台 (中国苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置荧光显微镜（Olympus公司）。电热恒温培 养箱（中国上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪（美 国Beckman公司）。J6-HC高速离心机（美国Beckman公司）。低温微量离心机（德国 Eppendorf公司）。振荡摇床（美国For