鼠的其他细胞作为第三种细胞。将第三种细胞培养至融合率85 %以上，除去细胞，获得第二种细胞上清液，并将获得的二种上清液混合，从而制成所述细胞培养用组合物。第三种细胞上清液与第一种和第二种细胞上清液的混合液之间的体积比为9:1到1:9，优选5:1到1:5，最优选1:1。一个优选实施方式中，将第三种细胞培养至融合率85% -97%。另一个优选实施方式中，将第三种细胞培养至融合率90%以上，例如90%-97%，优选90%-95%。第三种细胞优选哺乳动物细胞。第三种细胞可以是肝细胞，例如人或鼠的肝细胞。
[0030]三种细胞的培养不分先后顺序，并且可在细胞培养后立即收集上清液使用或将上清液冻存待用。三种细胞的培养均按照本领域技术人员所知的任何合适的方法，例如可参见，《Essentials of Stem Cell B1logy)),Robert Lanza等，(2006);大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法，刘学忠等，江苏农业学报，2009，25(1):222?224 ;脂肪间充质干细胞的研究进展，黄炎炎娜等，黑龙江畜牧兽医科技版，2011，7:46-48 ;大鼠肝细胞的原代培养及鉴定，刘德敏等，天津医药，2006，34 (5):322-323。
[0031]本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人、猿、恒河猴、仓鼠、兔、马、猪、大鼠、小鼠等等。优选人、大鼠或小鼠。
[0032]另一优选的实施方式中，根据需要，本发明的方法还包括添加一种或多种选自以下的活性成分的步骤:胰岛素、胎球蛋白、亚油酸、转铁蛋白、地塞米松、FGF(成纤维细胞生长因子)、或亚砸酸钠，以适应不同细胞生长和/或分化的需要，例如地塞米松主要是用在如果有诱导细胞分化的需求时添加；FGF是生长因子，起补充培养液中FGF不足的作用；其他是营养型的添加成分。一个优选的实施方式中，以最终的细胞培养基为基础，上述活性成分添加的浓度可以为:胰岛素10 5-10 7M,胎球蛋白0.2-0.8mg/mL，亚油酸0.5-2 μ g/mL，转铁蛋白 25-75 μ g/mL，地塞米松 10 6_10 SM，FGF50_200ng/mL，亚砸酸钠 3 X 10 7_3X 10 9M ;最优选，添加胰岛素10 6M，胎球蛋白0.5mg/mL，亚油酸1 μ g/mL，转铁蛋白51 μ g/mL，地塞米松10 7M，FGF100ng/mL，和亚砸酸钠 3X 10 SM。
[0033]—个优选的实施方式中，本发明的活性成分组合物或本发明的细胞培养基用于干细胞、例如脂肪干细胞(例如，脂肪间充质干细胞)、尤其是人或小鼠的脂肪干细胞(例如人或小鼠的脂肪间充质干细胞)、或骨髓间充质干细胞(例如大鼠骨髓间充质干细胞)的培养。
[0034]为本发明的目的，术语“脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs) ”指来源于脂肪组织的干细胞，具体而言，脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的具有多向分化潜能的干细胞。在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选哺乳动物尤其是人的脂肪组织。
[0035]本文中的术语“成纤维细胞”包括所有来源的成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞(例如人真皮成纤维细胞)、肌成纤维细胞等等。
[0036]本文中，术语“细胞上清液”、“细胞培养上清液”和“上清液”可互换使用，指细胞经培养之后，除去细胞例如滤除细胞后得到的液体。
[0037]本发明还提供用本发明上述方法制备的细胞培养用活性成分组合物。该组合物是两种或三种细胞培养上清液的混合液。所述组合物可通过包括以下步骤的方法制备:1)培养第一种细胞，所述细胞为哺乳动物脂肪干细胞，培养至融合率80 %以上，除去细胞，获得第一种细胞上清液；2)培养第二种细胞，所述细胞为哺乳动物成纤维细胞，培养至融合率80%以上，除去细胞，获得第二种细胞上清液；以及3)将以上两种上清液混合，从而制成所述细胞培养用活性成分组合物。
[0038]—个优选实施方式中，上述方法除包括培养第一种和第二种细胞之外，还任选包括培养第三种细胞，尤其是当预期用本发明的细胞培养基培养的细胞与所述第一种和/或第二种细胞不来源于同一物种时，优选培养第三种细胞，该第三种细胞与预期用本发明的细胞培养基培养的细胞来自于同一物种。例如，如果制备用于鼠胚胎纤维原细胞的培养基，则选择大鼠肝细胞或鼠的其他细胞作为第三种细胞。将第三种细胞培养至融合率85%以上，除去细胞，获得第三种细胞上清液，并将获得的三种上清液混合，从而制成所述细胞培养用组合物。
[0039]本发明还提供一种细胞培养基，包括细胞基础营养培养基和本发明的活性成分组合物，通过将本发明的活性成分组合物添加到细胞基础营养培养基中而中制成。本发明的活性成分组合物添加到基础营养培养基中的量为，活性成分组合物占基础营养培养基的5-25体积%，优选10-20体积%。
[0040]本发明中的“基础营养培养基”或“细胞基础营养培养基”可互换使用，均取其广义，即指能够为所需类型的细胞提供基础营养需求的任何合适的培养基。基础营养培养基包括但不限于 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、或 MEM (minimum essentialmedium)培养基。
[0041]本发明的细胞培养基中还可根据具体需要(例如干细胞定向诱导分化为具体的细胞类型)而添加其他成分。
[0042]本发明还提供一种细胞培养方法，所述方法包括使用本发明的活性成分组合物或本发明的细胞培养基的步骤。
[0043]本发明另外提供本发明的活性成分组合物或本发明的细胞培养基在细胞培养中的用途，所述细胞培养优选干细胞培养，例如脂肪干细胞(例如，脂肪间充质干细胞)，尤其是人脂肪干细胞(例如人脂肪间充质干细胞)，或骨髓间充质干细胞(例如大鼠骨髓间充质干细胞)。
[0044]下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不以任何方式限制本发明的范围。本发明的范围仅由所附的权利要求书限定。本领域技术人员在阅读了本公开内容之后，可在不脱离本发明精神和范围的情况下对本发明做出多种改动和变化，这些改动和变化都应认为是本发明实施方式的等同形式而落在本发明的范围内。另外，本申请书中(包括以上说明书和下文的实施例以及权利要求书)阐述的本发明的各个特征可以互相组合而形成新的特征，限于篇幅，本文不再赘述，但需要指出，这些新的特征也在本发明涵盖的范围内。
[0045]实施例
[0046]实施例1
[0047]—.人脂肪干细胞培养上清液的制备
[0048]1.人脂肪干细胞培养基的准备
[0049]使用Gibco公司的MesenPRO减血清细胞培养基(血清含量2% )作为基础培养基，化冻后于暗处储存于4°C，并于15天内用完。
[0050]2.细胞准备
[0051]人脂肪干细胞购自中科院上海细胞库，转移进50ml离心管内，1500rpm离心大约3分钟，用MesenPRO培养基将沉淀吹起，取100 μ L用0.4%台盼蓝染色镜检，记录视野内情况，并用血球计数板计数。
[0052]3.接种
[0053]人脂肪干细胞接种至康宁225毫升细胞培养瓶，每瓶接种量为2X 106个细胞。轻摇以使细胞分散均匀。
[0054]4.将人脂肪干细胞培养瓶于37°C培养箱进行培养(二氧化碳含量5% )，至细胞融合率达到85%以上。
[0055]5.轻摇培养瓶，然后将人脂肪干细胞培养上清液通过一个0.2 μ m的滤膜转移至无菌聚碳酸酯瓶中。
[0056]6.人脂肪干细胞细胞传代，每7天传代一次，每次传代后保证每细胞瓶(225毫升)细胞数量不低于2X106个。
[0057]7.每次传代后的人脂肪干细胞培养上清液于下次传代前如步骤5方法收集冻存于-20。。。
[0058]二.人成纤维细胞培养上清液的制备
[0059]8.人成纤维细胞的准备
[0060]人成纤维细胞购自中科院上海细胞库，转移进50ml离心管内，1500rpm离心大约3分钟，细胞沉淀用ScienCell公司成纤维细胞培养基(货号2301)吹起，取100 μ L用0.4%台盼蓝染色镜检，记录视野内情况，并用血球计数板计数。
[0061]9.接种
[0062]人成纤维细胞接种至康宁225毫升细胞培养瓶，每瓶接种量为2X 106个细胞。轻摇以使细胞分散均匀。
[0063]10.将培养瓶于37°C培养箱进行培