一种溶藻弧菌的快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产品生物检测技术领域，特别涉及一种溶藻弧菌的快速检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 弧菌（Vibrio)是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌，广泛分 布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。目前弧菌有91种。主要鱼贝类致菌为： 溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌等；有些弧菌也能引起人类疾病如：溶藻 弧菌、创伤弧菌等。
[0003] 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)是水产养殖业中常见的致病菌，对水生动物包 括鱼类、双壳贝类、甲壳类和棘皮动物等的养殖造成了巨大的损失。近年研究证实溶藻弧菌 也是沿海地区腹泻病和食物中毒的常见病原菌，可引起人类食物中毒、中耳炎和败血症等。
[0004] 在水产品的致病微生物检测中，溶藻弧菌逐渐成为进出口检验检疫的关注对象， 其快速检测技术具有重要意义。近几年有检测溶藻弧菌的多种方法报道，如酶联免疫吸附 试验（ELISA)、免疫组化、PCR方法等，然而传统PCR检测需要经过变性一退火一延伸，加上 DNA提取整个过程大概需要2-4小时才能得出结果。这些方法在成本、灵敏度、操作方便性 上存有缺陷，一定程度上限制了它们在生产中的实际应用，新的分子生物学技术如DNA指 纹技术、实时荧光定量PCR和DNA微阵列技术逐渐被应用于弧菌病原的检测，但这些技术对 仪器设备要求高，且需要专业操作，在适用性上具有局限性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于以溶藻弧菌特异性靶基因中与其毒力作用呈线性相关的主要 致病因子-aspA基因为靶基因，设计特异性引物，实现定向扩增，从而提供一种溶藻弧菌的 快速检测试剂盒，用于实时、快速、准确的检测溶藻弧菌。
[0006] LAMP技术是一种新兴的核酸等温扩增技术，该技术针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核 酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一 步增强了反应的特异性和缩短了检测时间，特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条 件下就能完成反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。
[0007] 本发明利用LAMP技术结合溶藻弧菌的特异性靶基因，实现快速检测，其主要原理 为：①设计一组能特异识别靶DNA的六个不同序列的两个内引物（上游内引物和下游内引 物）和两个外引物（上游外引物和下游外引物），内引物包含靶DNA的正义链和反义链；② 其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成，在具有高度链置换活性的DNA 聚合酶的参与下，由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个 内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA ;③内引物以原始的 茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长 度的茎环DNA ;④在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA 反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到IO9拷贝，最后通过加 入荧光染料来观察扩增结果。
[0008] -种溶藻弧菌的快速检测试剂盒，包括优化的LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和 LAMP显色液；其中，所述优化的LAMP反应液中含有引物，是通过GenBank公布的溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)与其它同源序列比对后，选取特异性 保守序列，利用LAMP引物在线设计软件设计的。
[0009] 本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其中，所述的LAMP反应液中的引物包 括两对，上游内引物、上游外引物、下游内引物、下游外引物：
[0010] 上游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；
[0011] 下游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0012] 上游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0013] 下游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0014] 本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其中，所述优化的LAMP反应液由如下 物质构成：Thernopo 1反应缓冲液、I OmM dNTPs溶液、20μΜ上游内引物、20μΜ下游内引物、 10 μ M上游外引物、10 μ M下游外引物、4Μ甜菜碱溶液、36mM MgSO4、灭菌去离子水。
[0015] 本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其中，所述Thernopol反应缓冲液含 有20mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、IOmM氯化钾、IOmM硫酸铵、2mM硫酸镁、 0. 1 % 曲拉通 X-100。
[0016] 本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其中，每微升所述Bst DNA聚合酶中含 有8个活性单位；所述LAMP显色液中含有10% SYBR Green I的荧光染料。
[0017] 本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其中，每个独立包装的所述优化的 LAMP反应液的体积为23微升，其中包括2. 5微升ThermoPol反应缓冲液、1微升dNTPs溶 液、0. 5微升上游内引物、0. 5微升下游内引物、0. 25微升上游外引物、0. 25微升下游外引 物、3. 75微升甜菜碱溶液、4微升MgSO4、和10. 25微升灭菌去离子水。
[0018] 采用本发明所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
[0019] (1)细菌DNA的提取：
[0020] 取ImL过夜培养的细菌菌液，室温8000rpm离心Imin收集菌体，按Ezup柱式细菌 基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取细菌DNA ;
[0021] (2)溶藻弧菌的环介导等温扩增：
[0022] a.在装有23微升LAMP反应液中加入1微升待检摸板DNA，于恒温水浴槽中95摄 氏度放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；
[0023] b.在反应管中加入1微升Bst DNA聚合酶；
[0024] c.于恒温水浴槽浴中60-65摄氏度放置30-60分钟；
[0025] d.将恒温水浴调到80摄氏度保温5分钟后取出；
[0026] (3)电泳及显色检测：
[0027] 扩增后的产物，通过电泳检测确定其灵敏度，LAMP法的扩增产物是各种不同长度 的茎一环状结构DNA，因此阳性反应通过琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯 形扩增条带出现，在反应管中加入1微升显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，阳性反应为荧 光绿色，说明待检细菌样品为溶藻弧菌，阴性反应保持SYBR Green I染料的荧光橙色，说明 待检细菌样品不是溶藻弧菌。
[0028] 本发明溶藻弧菌的快速检测试剂盒与现有技术不同之处在于：
[0029] 本发明中溶藻弧菌的快速检测试剂盒采用的引物对是通过GenBank公布的溶藻 弧菌（Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)与其它同源序列比对后，选取特 异性保守序列，利用LAMP引物在线设计软件设计一套LAMP引物，包括内外两对引物，可以 保证检测不同来源的溶藻弧菌菌株的可靠性。本发明采用LAMP技术，该技术特异性强，灵 敏度高、不需昂贵的PCR仪，只需普通的恒温水浴槽即可，扩增结果使用荧光染料来观察即 可，检测方法易行，操作简便，且成本低廉，特异性强，所检测的阴性对照菌株均无阳性结果 出来，与PCR检测结果一致。本发明得最低检测限为10 1Iig · uL \灵敏度比普通PCR反应 高100倍。
[0030] 本发明特异性强，敏感性高，简便快速，可用于实时、快速、准确的检测溶藻弧菌。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明快速检测试剂盒灵敏度实验结果中LAMP反应结果；
[0032] 图2是本发明快速检测试剂盒灵敏度实验结果中是PCR反应结果；
[0033] 图3是本发明快速检测试剂盒特异性检测结果，横坐标1-8分别为：1、哈氏弧菌； 2、河流弧菌；3、霍乱弧菌；4、英诺克李斯特氏菌；5、单增李斯特氏菌；6、副溶血弧菌；7、金 黄色葡萄球菌；8、溶藻弧菌。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本 发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0035] -种溶藻弧菌的快速检测试剂盒，包括优化的LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和 LAMP显色液；其中，所述优化的LAMP反应液中含有引物，是通过GenBank公布的溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)aspA基因序列（DQ097160)与其它同源序列比对后，选取特异性 保守序列，利用LAMP引物在线设计软件设计的。
[0036] 所述的LAMP反应液中的引物包括两对，上游内引物、上游外引物、下游内引物、下 游外引物：