>[0037] 上游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；
[0038] 下游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0039] 上游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0040] 下游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0041] 所述优化的LAMP反应液由如下物质构成：Thernopol反应缓冲液、IOmM dNTPs溶 液、20 μ M上游内引物、20 μ M下游内引物、10 μ M上游外引物、10 μ M下游外引物、4M甜菜碱 溶液、36mM MgSO4、灭菌去离子水。
[0042] 所述Thernopol反应缓冲液含有20mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、 IOmM氯化钾、IOmM硫酸铵、2mM硫酸镁、0. 1 %曲拉通X-100。
[0043] 每微升所述Bst DNA聚合酶中含有8个活性单位；所述LAMP显色液中含有10 % SYBR Green I的荧光染料。
[0044] 每个独立包装的所述优化的LAMP反应液的体积为23微升，其中包括2. 5微升 ThermoPol反应缓冲液、1微升dNTPs溶液、0. 5微升上游内引物、0. 5微升下游内引物、0. 25 微升上游外引物、0. 25微升下游外引物、3. 75微升甜菜碱溶液、4微升MgSO4、和10. 25微升 灭菌去离子水。
[0045] 1、溶藻弧菌（GHCC G頂1.451)购自广东省微生物菌种保藏中心
[0046] 阴性对照菌金黄色葡萄球菌（CICC 10384、CICC 21600)、副溶血弧菌（CICC 21617)、购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；单增李斯特氏菌（GHCC G頂1. 347)、英诺 克李斯特氏菌（GHCC G頂1. 365)、霍乱弧菌（GHCC G頂1. 449,购自广东省微生物菌种保藏 中心；河流弧菌（CGMCC 1. 1608)、哈氏弧菌（CGMCC 1. 1593)购自中国普通微生物菌种保藏 管理中心。
[0047] 2、主要试剂及仪器：营养肉汤、碱性蛋白胨水、BHI肉汤、海水2216E液体培养基均 购自北京陆桥技术有限责任公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工。
[0048] 3、引物设计、合成：通过GenBank公布的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus) aspA 基因序列（DQ097160)与其它同源序列比对后，选取特异性保守序列，利用LAMP引物在线设 计软件Primer Explorer V4设id套LAMP引物，包括内外两对引物，引物交由生工生物工 程（上海）股份有限公司合成。
[0049] 上游内引物（VA-FIP) :5'-
[0050] GCCGTGCCCATTACAGTCACTTGTTGAGTTCGGTGGTCGC-3'
[0051] 下游内引物（VA-BIP) :5'_
[0052] GCGGCAGCTTGTATGGTGTTGAACCCGATCCGGTACAGC-3'
[0053] 上游外引物（VA-F3) :5'-ACTGGTGTGAATGACGCG-3'
[0054] 下游外引物（VA-B3) :5'-CCGGCAATAACACCAGAAGT-3'
[0055] 4、模拟污染水产品样品DNA的提取：
[0056] 样品处理：取溶藻弧菌阴性的水产品样品，加入90mL碱性蛋白胨水，匀浆，加入 ImL浓度约I. 9 X 107CFU/mL的溶藻弧菌充分混匀，置36 ± I °C培养8-18h得增菌液。
[0057] DNA提取：取上述增菌液lmL，8000rpm离心lmin，弃上清，所得菌体按照Ezup柱式 细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取样品DNA。
[0058] 5、LAMP反应灵敏度实验：将溶藻弧菌DNA模板进行梯度稀释，稀释DNA模板量从 IOOng · uL \ IOng · uL \ Ing · uL \ 10 1Iig · uL \ 10 2ng · uL \ 10 3ng · uL \ 10 4ng · uL 1 梯 度，分别进行LAMP试验与PCR实验，比较其灵敏性。
[0059] 结果表明（见图1和图2) :LAMP试验的最低检测限为10 1Iig *uL \而PCR反应的 最低检测限为IOng · uL \ LAMP试验的灵敏度比普通PCR反应高100倍。
[0060] 6、试剂盒的特异性检测：将溶藻弧菌以及阴性对照：霍乱弧菌、哈氏弧菌、河流弧 菌、英诺克李斯特氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌培养过夜，取Iml培 养菌液提取DNA，利用LAMP快速检测试剂盒进行检测，检验方法的特异性。
[0061] 如图3结果显示，在加入显色剂后，溶藻弧发生扩增，颜色变为荧光绿色，LAMP检 测结果检测结果为阳性，其余7种阴性对照菌均未出现扩增，保持SYBR Green I染料的荧 光橙色，LAMP检测结果呈阴性，表明该方法可以特异性识别溶藻弧菌。
[0062] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：包括优化的LAMP反应液、BstDNA聚 合酶和LAMP显色液；其中，所述优化的LAMP反应液中含有两对引物： 上游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:1所示； 下游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:2所示； 上游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:3所示； 下游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:4所示。2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：所述优化的LAMP 反应液由如下物质构成：Thernopol反应缓冲液、10mM dNTPs溶液、20μΜ上游内引物、 20μΜ下游内引物、10μΜ上游外引物、10μΜ下游外引物、4Μ甜菜碱溶液、36mM MgS04、灭菌 去离子水。3.根据权利要求2所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：所述Thernopol 反应缓冲液含有20mMpH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸 铵、2mM硫酸镁、0. 1%曲拉通X-100。4.根据权利要求3所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：每微升所述Bst DNA聚合酶中含有8个活性单位；所述LAMP显色液中含有10% SYBR Green I的荧光染料。5. 根据权利要求4所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：每个独立包装的 所述优化的LAMP反应液的体积为23微升，其中包括2. 5微升ThermoPol反应缓冲液、1微 升dNTPs溶液、0. 5微升上游内引物、0. 5微升下游内引物、0. 25微升上游外引物、0. 25微升 下游外引物、3. 75微升甜菜碱溶液、4微升MgS04、和10. 25微升灭菌去离子水。6. 采用权利要求1~5中任意一种所述的溶藻弧菌的快速检测试剂盒进行检测的方 法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 细菌DNA的提取： 取lmL过夜培养的细菌菌液，室温8000rpm离心lmin收集菌体，按Ezup柱式细菌基因 组DNA抽提试剂盒的说明书提取细菌DNA; (2) 溶藻弧菌的环介导等温扩增： a. 在装有23微升LAMP反应液中加入1微升待检摸板DNA，于恒温水浴槽中95摄氏度 放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟； b. 在反应管中加入1微升BstDNA聚合酶； c.于恒温水浴槽浴中60-65摄氏度放置30-60分钟； d.将恒温水浴调到80摄氏度保温5分钟后取出； (3) 电泳及显色检测： 扩增后的产物，通过电泳检测确定其灵敏度，LAMP法的扩增产物是各种不同长度的 茎一环状结构DNA，因此阳性反应通过琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形 扩增条带出现，在反应管中加入1微升显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，阳性反应为荧光 绿色，说明待检细菌样品为溶藻弧菌，阴性反应保持SYBRGreenI染料的荧光橙色，说明待 检细菌样品不是溶藻弧菌。
【专利摘要】本发明公开了一种溶藻弧菌的快速检测试剂盒，包括优化的LAMP反应液、Bst？DNA聚合酶和LAMP显色液；其中，所述优化的LAMP反应液中含有两对引物：上游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO:1所示；下游内引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO:2所示；上游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO:3所示；下游外引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO:4所示。本发明所述溶藻弧菌的快速检测试剂盒特异性强，敏感性高，操作简便快速，可用于溶藻弧菌的快速检测。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105400891
【申请号】CN201510974197
【发明人】黄强
【申请人】山东恒诚检测科技有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月22日