薏苡黑穗病菌检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物保护领域，具体涉及一种准确且操作简单的薏苡黑穗病检测的方法。
【背景技术】
[0002]薏苡在我国各地均有种植，是传统的药食兼用作物。黑穗病是薏苡生产上危害最为严重的病害之一，感病地区的产量损失为30-50%，严重时达到80-100%。该病由薏苡黑粉病菌引起，为苗期侵染的系统性病害，带菌种子和土壤中越冬的冬孢子是薏苡黑穗病的初侵染源，破坏植株穗部花器，使其最终变为包含黑色厚垣孢子的黑穗。
[0003]薏苡黑穗病是一种真菌型病害，传统检测植物病原真菌的方法主要包括形态观察、症状诊断和生物学特性检测，并结合柯赫氏法进行鉴定，该方法不仅费时费力，且对于发病症状相似的病害难以做出准确的判断。近代发展起来的植物真菌病害分子检测技术包括4种，分别为DNA探针技术、基于PCR的DNA检测技术、DNA指纹技术和DNA芯片技术，其中基于PCR技术的病原分子诊断方法操作简便、结果准确且在一般的分子生物实验室都可以进行病菌检测，有利于育种家们在病害大面积发生前做好防治工作，已经在多种作物中广泛建立。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种结果准确且操作简单的薏苡黑穗病检测方法。
[0005]本发明的技术方案如下:
本发明是一种操作简单、结果准确的薏苡黑穗病检测方法，包括薏苡黑穗病病原菌分离、病原菌基因组DNA提取、PCR扩增和电泳检测等步骤，下面进行详细说明:
(1)薏苡黑穗病病原菌分离:从薏苡植株上剪除含有薏苡黑穗病菌的花苞并对其外表面进行消毒后置于超净工作台上，用无菌小刀划破花苞，出现黑色粉末，即黑穗病病菌孢子，将花苞中的黑穗病病菌抖落到灭过菌的报纸上，然后用无菌解剖针取少许黑穗病病菌孢子，置于无菌水中进行稀释，再接种于马丁氏培养基上，28°C暗培养，直到培养基上长出密生的白色菌丝。挑取单孢菌落接种到马铃薯液体培养基(含30mg/L链霉素)中，28°C，220rpm摇菌，暗培养36h。
[0006](2)病原菌基因组DNA提取:对马铃薯培养基中的大量菌丝进行离心收集，转入研钵中，加入石英砂、PVP和液氮，迅速研磨破碎细胞；然后快速转入到2mL离心管中，加入 65°C预热的 DNA 提取液(2% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, 1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，浓度2% PVP，浓度1% SDS，pH为8.0，提取液使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%) 0.8mL，涡旋混匀，65°C水浴30min，其间上下颠倒3_5次；冷至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提，上下颠倒混匀后，4°C离心lOmin，离心转速为12000 rpm ;小心吸取上清液转移至新的2mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液进行第二次抽提，4°C离心lOmin，离心转速为12000 rpm ;小心吸取上清，加入2倍体积预冷的乙醇，至于_80°C冰箱中助沉30min ;恢复至室温后，4°C离心lOmin，离心转速为12000 rpm ;去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，每次洗涤后4°C离心8min，离心转速为12000 rpm ;用无水乙醇洗涤沉淀一次，4°C离心8min，离心转速为12000 rpm ;在超净工作台上吹干沉淀，加入30 μ L灭菌水，取3 μ L进行琼脂糖电泳检测DNA质量，保存于-20°C冰箱中备用。
[0007](3)薏苡黑穗病病原菌分子检测:以黑粉菌属配型基因特异性引物bE4/bE8为本检测体系所用引物，
bE4:5 ’ CGCTCTGGTTCATCAACG3’，bE8:5 ’ TGCTGTCGATGGAAGGTGT3’。
[0008]反应体系总体积为25 yL:薏苡黑穗病病原菌DNA 1.0 μ L, dNTP(2.5mM) 2.0yL，bE4(10 μ Μ) 1.0 yL，bE8(10 μ Μ) 1.0 yL，10X Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μ L，ddH20 17.3 μ LTaq 酶(3U/μ L) 0.2 yL。
[0009]反应条件为:94°C 3 min ；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，35 个循环；72°C 10 min。PCR产物跑1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，获得片段大小为459bp的扩增产物。
[0010]本发明的优点是用利用分子生物学技术建立了基于PCR技术的薏苡黑穗病检测方法，代替了传统的形态学观察和指示植物法，使病原菌的检测快速、准确且易于操作。同时，本方法获得的PCR扩增产物，还可以通过测序对不同来源的病原菌进行分类学或遗传多样性的研究。
【附图说明】
[0011]图1为薏苡黑穗病菌PCR检测琼脂糖电泳图，图中，l:marker DL2000; 2:阳性对照，3 μ L ;3:从感病黔薏1号分离的黑穗病病原菌PCR结果，5 μ L; 4:从感病兴仁小白壳分离的黑穗病病原菌PCR结果，5yL。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0013]实施例1:
如图1所示，以黔薏1号和兴仁小白壳分别为原料，按如下步骤实施:
(1)从薏苡植株上剪除因感染薏苡黑穗病菌而膨大的花苞，对其外表面进行消毒后置于超净工作台上，用无菌小刀将其划破，将花苞中的黑穗病病菌抖落到灭过菌的报纸上，用无菌解剖针取少许黑穗病病菌孢子，置于无菌水中进行稀释，再接种于马丁氏培养基上，28°C暗培养，直到培养基上长出密生的白色菌丝。
[0014](2)挑取培养基上单孢菌落接种到马铃薯液体培养基(含30 mg/L链霉素)中，28°C，220 rpm摇菌，暗培养36 h。
[0015](3)对马铃薯培养基中的大量菌丝进行离心收集，转入研钵中，加入石英砂、PVP和液氮，迅速研磨破碎细胞；然后快速转入到2 mL离心管中，加入65 °C预热的DNA提取液0.8mL，涡旋混匀，65 °C水浴30 min，其间上下颠倒3_5次。
[0016](4)冷至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提，上下颠倒混匀后，4 V离心10 min，离心转速为12000 rpm。
[0017](5)小心吸取上清液转移至新的2 mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液进行第二次抽提，4°C离心10 min，离心转速为12000 rpm。
[0018](6)小心吸取上清，加入2倍体积预冷的乙醇，至于_80°C冰箱中30 min ;恢复至室温后，4°C离心lOmin，离心转速为12000 rpm。(7)去除上清，沉淀用70 %乙醇洗涤两次，每次洗涤后4 °C离心8 min，离心转速为12000 rpm。
[0019](8)用无水乙醇洗涤沉淀一次，4 °C离心8 min，离心转速为12000 rpm ;在超净工作台上吹干沉淀，加入30 μ L灭菌水，取3 μ L进行琼脂糖电泳检测DNA质量，保存于-20°C冰箱中备用。
[0020](9) PCR反应体系总体积为25 μ L:薏苡黑穗病病原菌DNA 1.0 μ L，dNTP (2.5mM)
2.0 yL, bE4(10 μΜ) 1.0 μ L，bE8 (10 μ Μ) 1.0 μ L，10 X Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μ L，ddH2017.3 yL Taq 酶(3U/yL) 0.2 μ L。反应条件为:94 °C 3 min ；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72°C 30 s，35个循环；72 °C 10 min。PCR产物跑1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，获得片段大小为459bp的扩增产物。
[0021]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种薏苡黑穗病菌检测的方法，其特征在于:在有薏苡黑穗病病症的薏苡植株上分离薏苡黑穗病病原菌，对含有薏苡黑穗病病原菌的花苞表面进行消毒，用马丁氏培养基筛选获得单孢菌落，然后用马铃薯液体培养基将单孢菌落扩大培养，获得大量的病原菌；利用CTAB法提取薏苡黑穗病病原菌基因组DNA，用黑粉菌属配型基因特异性引物bE4/bE8对其进行扩增，若能扩增出一条长459bp黑穗病菌特异保守序列的目的片段，则证明所分离的病菌为薏苡黑穗病病原菌。2.根据权利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌检测方法，其特征在于:实验材料是从田间采集含有感染黑穗病病原菌的未破裂花苞的薏苡植株顶端部分，将整个花苞从蒂部剪掉后即得。3.根据权利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌检测方法，其特征在于:所述马丁氏培养基筛选是将完整的花苞外表面进行75%乙醇消毒，放置于超净工作台中的无菌报纸上，用无菌刀片划开花苞，将花苞中的黑穗病病菌抖落到灭过菌的报纸上，然后用无菌解剖针取少许黑穗病病菌孢子，置于无菌水中进行稀释，分散接种在几个马丁氏培养基上，28°C暗培养48h，获得薏苡黑穗病的单孢菌落。4.根据权利要求1所述的薏苡黑穗病菌检测方法，其特征在于:将马丁氏培养基上长出的白色菌丝作为薏苡黑穗病病原菌，然后将其接种到马铃薯液体培养基中进行大量繁殖。5.根据权利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌检测方法，其特征在于:所述黑粉菌属bE交配型基因特异性引物bE4/bE8的序列分别为:bE4:5 ’ -CGCTCTGGTTCATCAACG-3’bE8:5 ’ -TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’。
【专利摘要】本发明公开了一种薏苡黑穗病检测的方法，它主要是从感病薏苡花苞中分离获得薏苡黑穗病病菌，然后对黑穗病菌提取DNA，利用黑粉菌属<i>bE</i>交配型基因特异性引物对其进行PCR扩增，以扩增产物有无和片段大小来确定病原菌是否为薏苡黑穗病。该方法较传统检测方法相比，操作简便、结果准确，而且获得的扩增产物还可进行其他分子生物学研究。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105400890
【申请号】CN201510968582
【发明人】杨成龙, 付瑜华, 罗凯, 王建, 蒙秋伊, 刘鹏飞, 周明强, 刘凡值, 李志芳, 黎青, 班秀文, 敖茂宏, 周祥
【申请人】贵州省亚热带作物研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月22日