的五环三萜类化合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学技术领域，具体涉及一种名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷 c6的五环三萜类化合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 山茶属植物茶(Camelliasinensis)如茶、山茶、阿萨姆茶、油茶、茶梅等植物的 根、茎、叶、花、籽等都含有齐墩果烷型五环三萜类皂苷，茶皂苷又称作茶皂素或茶皂甙。茶 皂苷是一种性能优良的天然非离子表面活性剂，不仅具有良好的乳化、发泡、分散、渗透、润 滑等活性作用，而且对皮肤真菌有抑制作用和明显的抗消炎功能。在农业上可用作杀虫剂、 杀菌剂、混凝土发泡剂、食品工业乳化剂、农药助剂等，这些都是农业和医药研究领域的研 究热点。
[0003] 油茶(CamelliaoleiferaAbel)是山茶属植物茶中的一种，是我国特有的木本食 用油料树种，主要分布于安徽、湖南、江西、福建、广东、广西等省份，在我国有上千年的栽培 种植历史。其油茶籽富含茶油和油茶皂苷，油茶籽经榨油以后的油茶饼柏中含有的皂苷总 量在8%以上，这些油茶皂苷具有调节血脂、降血压，抗肿瘤等用途。
[0004] 关于从油茶皂苷生物活性的化学基础的报道比较少，若能成功的从油茶籽饼柏这 以资源中研究开发出具有生物活性的五环三萜类皂苷化合物成分，将对农业和医药等领域 做出重要贡献。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种从油茶籽饼柏中分离制备得到的油茶皂苷C4、油茶 皂苷C5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合物，所述油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6结构 式分别如式(I)、式（Π)和式(m)所示：
[0008] 本发明的目的之二是提供一种上述名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的 五环三萜类化合物的制备方法，其包括以下步骤：
[0009] 1)取脱脂油茶籽饼柏，将其粉碎；
[0010] 2)用有机溶剂提取粉碎后的油茶籽饼柏，提取液经过减压浓缩制得膏状提取物；
[0011] 3)将所述膏状提取物分离纯化得到产物。
[0012]优选的，步骤2)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇。
[0013] 优选的，步骤2)中所述有机试剂提取为采用有机试剂浸泡提取，即将粉碎后的油 茶籽饼柏60°C下在有机溶剂中浸泡4小时，反复提取3次;或者将粉碎后的油茶籽饼柏用有 机溶剂超声波振荡提取，超声波振荡采用常规技术即可。
[0014] 优选的，步骤3)中所述的分离纯化是将所述膏状提取物用石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇依次萃取;将最终得到的正丁醇萃取液利用硅胶柱层析、羟丙基凝胶柱层析、反相硅胶制 备液相依次分离纯化得到产物。
[0015] 作为本发明的进一步的优选方案，所述硅胶柱层析是将正丁醇萃取液使用EtOAc-MeOH体积比100 :0到0 :100作为梯度洗脱，分别收集EtOAc-MeOH相应体积比之间的洗脱组 分，再经羟丙基凝胶柱层析以甲醇洗脱，收集相应洗脱成分，最后经反相硅胶制备液相以 CH3CN-H20体积比42:58洗脱，得到产物。
[0016] 作为本发明更进一步的优选方案，将所述正丁醇萃取液减压浓缩至膏状，用热水 溶解得到溶解液，再将溶解液通过1〇〇~200目的硅胶柱层析，以EtOAc-MeOH体积比100:0， 90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80，10:90,0:100 作为梯度洗脱，收集 其中70:30到60:40间的洗脱组分;将得到的洗脱组分再经过羟丙基凝胶柱层析即Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，每100毫升一馏分，收集其中的3~5馏分，将收集到的3~5 馏分合并、蒸干后再经过C18反相硅胶即十八烷基键合硅胶制备液相，以CH3CN-H20体积比 42:58洗脱，根据洗脱保留时间的不同可分别得到油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6。 [0017]本发明的目的之三是提供一种上述名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的 五环三萜类化合物在制备抗人肝癌细胞(BEL-7402 )、人低分化前胃癌细胞(BGC-823 )、人乳 腺癌细胞(MCF-7)、人白血病细胞(HL-60)和人口腔上皮癌细胞(KB)药物方面的应用。
[0018] 通过实验证实，本发明所述名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜 类化合物对癌细胞有抑制作用，可以应用于制备抗癌药物方面。
[0019] 本发明中的所述名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合物 可以和药学上所通用的辅料制成口服、外用、注射等剂型，例如片剂、胶囊剂、滴丸剂等口服 药剂;徐剂、洗剂、等外用药剂;注射液、混旋液、冻干粉沫等注射药剂，参照制药领域的常规 方法制备。
[0020] 本发明的有益效果如下：
[0021] 1)本发明提供了 3个具有生物活性的五环三萜类皂苷化合物，对农业和医药领域 具有重要的意义。
[0022] 2)本发明从油茶籽饼柏中制备得到了 3个具有医学活性的五环三萜类皂苷化合 物，为有效开发油茶提供了广阔的前景。
[0023] 3)本发明制备方法简单，成本较低。
【附图说明】
[0024] 图 1 中（a)、（b)、（c)分别为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5 (OleifearsaponinC5)和油茶阜苷C6(01eifearsaponinC6)的化学结构式。
[0025] 图2为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷C6(01eifearsaponinC6)对人肝癌细胞(BEL-7402)的体外抑制活性试验示意图。
[0026] 图3为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷〇6(0161€63^3口〇]1；[1106)对人低分化前胃癌细胞(1^0823)的体外抑制活性试验示 意图。
[0027] 图4为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷C6(01eifearsaponinC6)对人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抑制活性试验示意图。
[0028] 图5为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷〇6(016丨€63^3口〇]1；[1106)对人白血病细胞(1-60)的体外抑制活性试验示意图。
[0029] 图6为油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷〇6(016丨€63^3口〇]1；[1106)对人口腔上皮癌细胞(103)的体外抑制活性试验示意图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0032] 下面结合具体实施例来对本发明做进一步详细说明。
[0033] -、油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油茶 阜苷C6(01eifearsaponinC6)的制备
[0034] (1)取2.0公斤油茶籽饼柏，并将其粉碎；
[0035] (2)每次用10升70%乙醇在60°C下浸提粉碎后的油茶籽饼柏，每次浸泡4小时，共 浸提3次。70%的乙醇总量为30升。将所得提取液浓缩成浸膏，得浸膏350克；
[0036] (3)将上述所得浸膏悬浮于3L水中得到水混悬液，该水混悬液先用3L的石油醚依 次萃取3次后得到的第一步剩余水混悬液即为石油醚萃取过的水混悬液，此时石油醚的总 用量为9L;
[0037]将石油醚萃取过的水混悬液再用3L的乙酸乙酯依次萃取3次后得到的第二步剩余 水混悬液即为乙酸乙酯萃取过的水混悬液，此时乙酸乙酯的总用量为9L;
[0038] 将乙酸乙酯萃取过的水混悬液再用3L的正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液待 用，此时正丁醇的总用量为9L;
[0039]将所述正丁醇萃取液浓缩至膏状，用烘箱设置55°C烘干，约80克，然后称取80克的 硅胶与80克的正丁醇萃取物搅拌在一起，再经过100~200目的硅胶柱层析，以EtOAc-MeOH 体积比100:0,90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80，10:90,0:100进行梯 度洗脱，收集其中70:30到60:40间的洗脱组分(6.5克）；将得到的洗脱组分再经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，每100毫升一馏分，共得到20个馏分，将得到的馏分采用薄 层层析(TLC)法结合硫酸-乙醇显色反应检测，把Rf值相同的馏分进行合并，即收集其中的3 ~5馏分，将收集到的3~5馏分合并、蒸干(2.0克)再经过C18反相硅胶(十八烷基键合硅胶） 制备液相，以CH3CN-H20体积比42: 58洗脱，根据洗脱保留时间的不同可得到油茶皂苷C4 (OleifearsaponinC4,5.2晕克）、油茶阜昔C5(OleifearsaponinC5,6.7晕克）和油茶阜昔 C6(01eifearsaponinC6,8.0毫克）〇
[0040]产物油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶阜苷C6(01eifearsaponinC6)的特性如下：
[0041 ] 1)三者都可溶于甲醇和DMS0，白色粉末状固体；
[0042]2)油茶皂苷C4:UVAmax: 280nm;油茶皂苷C5:UVAmax: 280nm;油茶皂苷C6:υνλΜΧ: 280nm；
[0043] 3)油茶皂苷C4:HR-ESI-MS:m/z1107 · 5358([M+Na] +，C54H84〇22，的理论计算值为 1084 · 5454);油茶皂苷C5 :HR-ESI-MS:m/z1345 · 5824( [M+Na] +，C65H94〇28,的理论计算值为 1322 · 5932);油茶皂苷C6:HR-ESI-MS:m/z1269 · 5875([M+Na] +，C6qH94〇27，的理论计算值为 1246.5982);油茶皂苷C4油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的核磁共振光谱数据见表1。
[0044] 表1:油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷〇6(0161€63183口〇11111〇6)的核磁共振光谱数据(111匪1?在6001!^，13〇匪1?在1501抱条 件下测试，S单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代吡啶）。
[0045] 表1.油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的核磁共振光谱数据
[0046]
[0049] 所有波谱数据通过1HNMR，13CNMR，DEPT-90，DEPT-135和1H-1HC0SY，HSQC，HMBC和 N0ESY等核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。
[0050] 二、油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油茶 阜苷C6(01eifearsaponinC6)的体外抑制肿瘤细胞活性试验
[0051 ]对人肝癌细胞(BEL-7402 )、人低分化前胃癌细胞(BGC-823 )、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人白血病细胞(HL-60)和人口腔上皮癌细胞(KB)的体外抑制试验:采用MTT法。
[0052]实验方法：
[0053] 1、将上述五种癌细胞分别消化、计数、配制成浓度为3~4X104个/mL的细胞悬液， 于96孔细胞培养板中每孔加入100yL细胞悬液(每孔3~4X103个细胞）；
[0054] 2、将96孔细胞培养板置于37°C，5%C〇2培养箱中培养24小时；