r>[0055] 3、用完全培养基稀释分别药物油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6至所需浓度 (5(^]?、25以]\1、12.5以]\1、6.25以]\1、3.125以]\1、1.5625以]\1、0.78125以]\1、0.390625以]\1八个浓度梯度）， 每孔加入l〇〇yL相应的含药培养基(DMEM)，同时设立阴性对照组，阳性对照组（紫杉醇注射 液lOyg/mL);
[0056] 4、将96孔细胞培养板置于37°C，5%C〇2培养箱中培养72小时；
[0057] 5、将96孔板进行MTT染色，λ= 490nm，测定0D值；
[0058] 1)每孔加入20yLMTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；
[0059] 2)弃去培养基，每孔加入150yLDMS0溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；
[0060] 3)λ= 490nm，酶标仪读出每孔的0D值，计算抑制率；
[0061] 6、计算各组别抑制率和IC5Q值。
[0063]产物油茶阜苷C4(〇leifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponin C6)针对人肝癌细胞(BEL-7402)的体外抑制效果和IC5Q值见表 2：
[0064]表2.油茶阜苷C4(01eifearsaponin C4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponin C5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponin C6)针对人肝癌细胞(BEL-7402)的体外抑制效果和1(：50值
[0067] 产物油茶阜苷C4(01eifearsaponin C4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponin C5)和油 茶皂苷CdOleifearsaponin C6)针对人低分化前胃癌细胞(BGC-823)的体外抑制效果和 IC50值见表3:
[0068] 表3.油茶阜苷C4(01eifearsaponin C4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponin C5)和油 茶皂苷CdOleifearsaponin C6)针对人低分化前胃癌细胞(BGC-823)的体外抑制效果和 1。50值
[0070] 产物油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponinC6)针对人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抑制效果和IC5Q值见表 4：
[0071] 表4.油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponinC6)针对人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抑制效果和1(：50值
[0073] 产物油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponinC6)针对人白血病细胞(HL-60)的体外抑制效果和IC5Q值见表 5：
[0074] 表5.油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油茶阜苷C5(01eifearsaponinC5)和油 茶皂苷C6(01eifearsaponinC6)针对人白血病细胞(HL-60)的体外抑制效果和1(：50值
[0076] 产物油荼阜苷〇4(〇161€6&『8&卩011；!_11〇4)、油荼阜苷(^(〇161€6&『8&卩011；!_11(^)和油 荼皂苷(： 6(01以化&^&?〇1^11(：6)针对人口腔上皮癌细胞(仙)的体外抑制效果和1(： 5()值见表 6：
[0077] 表6 ·油荼阜苷C4(01eifearsaponinC4)、油荼阜苷C5(01eifearsaponinCs)和油 荼皂苷C6(01eifearsaponinC6)针对人口腔上皮癌细胞(KB)的体外抑制效果和IC50值
[0079] 如图2所示，图2中A、B分别为浓度为6.25μΜ、3. 125μΜ浓度的油茶皂苷C4(OleifearsaponinC4)，C、D分别为浓度为6 · 25μΜ、3 · 125μΜ浓度的油茶皂苷(：5 (OleifearsaponinC5)，E、F分别为浓度为12 · 5μΜ、6 · 25μΜ浓度的油茶皂苷C6 (OleifearsaponinC6)对人肝癌细胞(BEL-7402)的体外抑制效果图，G为阴性对照图。由图 2中的对比结果可以看出油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6对人肝癌细胞(BEL-7402)具 有显著抑制作用。
[0080] 如图3所示，图3中A、B分别为浓度为12. 5μΜ、6. 2 5μΜ浓度的油茶皂苷C4 (OleifearsaponinC4)，C、D分别为浓度为12 · 5μΜ、6 · 25μΜ浓度的油茶皂苷(：5 (OleifearsaponinC5)，E、F分别为浓度为25μΜ、12. 5μΜ浓度的油茶皂苷C6 (OleifearsaponinC6)对人低分化前胃癌细胞(BGC-823)的体外抑制效果图，G为阴性对照 图。由图3中的对比结果可以看出油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6对人低分化前胃癌 细胞(BGC-823)具有显著抑制作用。
[0081] 如图4所示，图4中A、B分别为浓度为6.25μΜ、3. 125μΜ浓度的油茶皂苷C4(OleifearsaponinC4)，C、D分别为浓度为12 · 5μΜ、6 · 25μΜ浓度的油茶皂苷(：5 (OleifearsaponinC5)，E、F分别为浓度为25μΜ、12. 5μΜ浓度的油茶皂苷C6 (01eifearsaponinC6)对人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抑制效果图，G为阴性对照图。由图4 中的对比结果可以看出油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6对人乳腺癌细胞(MCF-7)具有 显著抑制作用。
[0082] 如图5所示，图5中A、B分别为浓度为3. 125μΜ、1 .5625μΜ浓度的油茶皂苷C4 (OleifearsaponinC4)，C、D分别为浓度为3· 125μΜ、1 ·5625μΜ浓度的油茶皂苷C5 (OleifearsaponinC5)，E、F分别为浓度为12 · 5μΜ、6 · 25μΜ浓度的油茶皂苷C6 (OleifearsaponinC6)对人白血病细胞(HL-60)的体外抑制效果图，G为阴性对照图。由图5 中的对比结果可以看出油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6对人白血病细胞(HL-60)具有 显著抑制作用。
[0083] 如图6所示，图6中A、B分别为浓度为6.25μΜ、3. 125μΜ浓度的油茶皂苷C4 (OleifearsaponinC4)，C、D分别为浓度为12 · 5μΜ、6 · 25μΜ浓度的油茶皂苷(：5 (OleifearsaponinC5)，E、F分别为浓度为25μΜ、12. 5μΜ浓度的油茶皂苷C6 (01eifearsaponinC6)对人口腔上皮癌细胞(KB)的体外抑制效果图，G为阴性对照图。由图 6中的对比结果可以看出油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6对人口腔上皮癌细胞(KB)具 有显著抑制作用。
[0084]上述试验证明，本发明制备得到的产物油茶阜苷C4(01eifearsaponinC4)，油茶 阜苷C5(OleifearsaponinC5)和油茶阜苷C6(OleifearsaponinC6)对人肝癌细胞(BEL-7402)、人低分化前胃癌细胞(BGC-823)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人白血病细胞(HL-60)和人 口腔上皮癌细胞(KB)都有较强的细胞毒性。这两种五环三萜类油茶皂苷化合物在抗癌药物 的研发中将具有重要的应用前景。
【主权项】
1. 一种名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合物，其特征在于， 所述油茶皂苷C4、油茶皂苷(： 5和油茶皂苷C6结构式分别如式(I)、式（π)和式(m)所示，2. -种如权利要求1所述名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C 6的五环三萜类化合 物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取脱脂油茶籽饼柏，将其粉碎； 2) 用有机溶剂提取粉碎后的油茶籽饼柏，提取液经过减压浓缩制得膏状提取物； 3) 将所述膏状提取物分离纯化得到油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6。3. 根据权利要求2所述的油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合物的 制备方法，其特征在于:所述步骤2)中所述的有机溶剂为乙醇或甲醇。4. 根据权利要求2或3所述的名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类 化合物的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中有机试剂提取为采用有机试剂浸泡提取，即 将粉碎后的油茶籽饼柏于60°C有机溶剂中浸泡4小时，反复提取3次;或者将粉碎后的油茶 籽饼柏用有机溶剂超声波振荡提取。5. 根据权利要求2所述的名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合 物的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中的分离纯化是将所述膏状提取物用石油醚、乙酸 乙酯、正丁醇依次萃取;弃去石油醚和乙酸乙酯萃取物，将最终得到的正丁醇萃取液利用硅 胶柱层析、羟丙基凝胶柱层析、反相硅胶制备液相依次分离纯化得到油茶皂苷C 4、油茶皂苷 C5和油茶皂苷C6。6. 根据权利要求5所述的名为油茶阜苷C4、油茶阜苷C5和油茶阜苷C6的五环三砲类化合 物的制备方法，其特征在于：所述硅胶柱层析是将正丁醇萃取液使用EtOAc-MeOH体积比 100:0到0:100作为梯度洗脱，分别收集EtOAc-MeOH相应体积比之间的洗脱组分，再经羟丙 基凝胶柱层析以甲醇洗脱，收集相应洗脱成分，最后经反相硅胶制备液相以CH 3CN-H2O体积 比42:58洗脱，得到油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C 6。7. 根据权利要求5所述的名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合 物的制备方法，其特征在于:将所述正丁醇萃取液减压浓缩至膏状，用热水溶解得到溶解 液，再将溶解液通过100~200目的硅胶柱层析，以EtOAc-MeOH体积比100:0，90:10，80: 20， 70: 30，60:40，50: 50，40 :60，30 :70，20 :80，10:90，0:100作为梯度洗脱，收集其中 70: 30到 60:40间的洗脱组分;将得到的洗脱组分在经过羟丙基凝胶柱层析即Sephadex LH-20凝胶 柱层析，以甲醇洗脱，每100毫升一馏分，收集其中的3~5馏分，将收集到的3~5馏分合并、 蒸干后再经过C18反相硅胶即十八烷基键合硅胶制备液相，以CH 3CN-H2O体积比42: 58洗脱， 根据洗脱保留时间的不同可得到油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6。8. -种如权利要求1所述的名为油茶皂苷C4、油茶皂苷(：5和油茶皂苷C6的五环三萜类化 合物在制备抗人肝癌细胞、人低分化前胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人白血病细胞和人口腔上 皮癌细胞药物方面的应用。
【专利摘要】一种名为油茶皂苷C4、C5和C6的五环三萜类化合物及其制备方法与应用，在制备上述化合物时，首先取油茶籽饼粕，并将其粉碎；然后用有机溶剂提取粉碎后的油茶籽饼粕，提取液经过减压浓缩制得膏状提取物；再将所述膏状提取物分离纯化得到油茶皂苷C4、油茶皂苷C5和油茶皂苷C6。通过实验证实，本发明油茶皂苷C4、油茶皂苷C5和油茶皂苷C6的五环三萜类化合物对癌细胞有抑制作用，可用于制备抗人肝癌细胞(BEL-7402)、人低分化前胃癌细胞(BGC-823)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人白血病细胞(HL-60)和人口腔上皮癌细胞(KB)等抗癌药物。对农业和医药领域具有重要的意义，也为有效开发利用油茶提供了广阔的前景。
【IPC分类】C07H1/08, A61P35/02, C07J63/00, A61P35/00, C07H15/256
【公开号】CN105418722
【申请号】CN201510779731
【发明人】侯如燕, 宗建法, 宛晓春, 鲍官虎, 凌铁军, 张梁
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月12日