再转入 到15°C条件下暗培养24h，此时胚开始萌发，然后转移到28°C暗培养两天，方可获取遗传转 化的茎尖。低温处理以利于种子萌发的一致性，同时低温处理以利于提高生长组织的分化 率，时间可以自由调节，与后续的农杆菌培养的浓度达到一致。以在农杆菌最适的生长时期 侵染茎尖，以提高转化的效率。
[0096] 2、利用PCR扩增技术获得CrylAC抗虫基因，利用限制性内切酶酶切切除P3301载 体质粒中的⑶S基因，用T4连接酶将CrylAc抗虫基因连接到酶切后的P3301载体质粒中， 构建P3301-CrylAc抗虫植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌。
[0097]具体为：
[0098] 2. 1CrylAc的克隆
[0099] 利用人工合成的引物，以质粒pUC19Ac为模板进行扩增。
[0100]PCR反应体系（40yL):
[0101]
[0102] 注：Prime引物稀释：5'primer5μL+3'primer5μL+ddH20 240μL
[0103] 按照以下程序进行扩增：94°C预变性5min;94°C变性40sec;56°C退火45sec; 72°C延伸lmin，30个循环；72°C保持5min，4°C保温。
[0104] 2. 2大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
[0105] (1)从于37°C培养16-20h新鲜平板上挑取一个单菌落，接种于15mlLB液体培养 基的三角瓶中，37°C，190rpm振荡培养过夜（约14h)。
[0106] (2)取1. 6ml菌液接到一个含有14. 4mlLB液体培养基三角瓶中，37°C，210rpm培 养 90min〇
[0107] (3)再取出10ml菌液转接到一个含有90mlLB液体培养基三角瓶中，37°C，210rpm 培养lOmin
[0108] (4)将菌液分装到2个50ml离心管中，冰上放置10min，4°C，5000rpm离心7min， 倒出培养液，回收菌体，将管倒置lmin以便培养液流尽。（注意无菌操作）
[0109] (5)用冰预冷的0. 1MCaC12 (新鲜解冻的）0. 5ml在冰上用枪吸打，使其沉淀悬浮。 再补加0. 1MCaC12至20ml。立即放在冰上静置30min(从接触CaC12开始计时）。4°C， 5000rpm离心7min，回收菌体。加入2ml冰预冷的0. 1MCaC12悬浮细胞（冰浴上操作）。
[0110] (6)分装：感受态细胞85μL，加上15μL纯甘油。100μL分装，-80°c保存。
[0111] 2. 3农杆菌的准备
[0112] 农杆菌电击感受态细胞的制备及转化
[0113] (1)取单菌落接种于l〇ml液体YMBroth(0. 4g酵母提取物，10g甘露醇，0.lg NaCl，0.lgMgS04,0. 5gK2HP04 · 3H20,ρΗ7· 0,定容至 1L)中，28°C摇床培养过夜。
[0114] (2)取10ml按1 %接种于1LYMBroth培养液中，200转28°C摇菌3-4小时，至0D 值为 0.6-0. 8。
[0115] (3)，4°C，4000rpm离心lOmin，收集菌体。
[0116] (4)弃上清，菌体归于一管，加50ml预冷的超纯水悬浮细胞。
[0117] (5)4°C，4000rpm离心lOmin，弃上清，加100ml预冷的10%甘油悬浮细胞。
[0118] (6)重复 5。
[0119] (7)4°C，4000rpm离心10min，菌体悬于1. 5ml无菌预冷的1M山梨醇。
[0120] (8)将细胞悬液分装于0. 5ml小管中，每管200μ1。液氮速冻后现用或-80°C保存 备用。
[0121] (9)其转化参照大肠杆菌电击感受态细胞的转化。
[0122] 2. 4表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
[0123] 取100μ1感受态细胞，加入10μ1构建好的质粒DNA，冰浴30分钟，液氮中速冻 2min后37°C水浴2min，加入600μ1LB培养液，28°C慢速振荡培养3-4小时；lOOOOrpm离心 30sec收集菌，涂板于KTG平板上，28°C培养约24-36小时
[0124] 2. 5制备转化用的农杆菌菌液
[0125] 2. 5. 1灭菌试管400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml)。
[0126] 2. 5. 2 试剂：YEP1200ml(每瓶 300ml共 4 瓶）+Kan1 ;1000,Rifl:500。
[0127]1/2MS+2%蔗糖（灭菌 115 度 20 分钟），Silwet在 _20°C贮存。
[0128] 2.5.3
[0129] 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul:10ml接种。28°C， 3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1 :400)及750ul菌液转至汉 300毫升YEP+K50+Rif中培养28°C，300rpm约14小时，次日上午8点测0D值，用YEP+Rif作 为空白对照，当菌液达到0D600为1. 5~3. 0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）， 4°〇，4000区离心10111；[11。用10%鹿糖（含0.02%8；[1?^1:)稀释至00600 约为0.8-1. 0 左 右即，用10%蔗糖作对照。转化时将茎尖在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
[0130] 二、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化：
[0131] 1)玉米成熟胚茎尖的获取：
[0132] 待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方l_2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉 丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位纵切第二刀，切口稍越过结的下线，用刺针刺伤 生长点上端，在高渗培养基中放置lh以上。
[0133] 2)茎尖的侵染：
[0134] 从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农 杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖5min。
[0135] 3)茎尖和根癌农杆菌的共培养：
[0136] 取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养 基上在24-28°C共培养3d。
[0137] 4)茎尖的恢复培养：
[0138] 将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24Γ下培养至从生长点部位萌生出新 的幼叶。
[0139] 在转苗的过程中要小心操作，尽量避免沾染菌液的芽尖碰到培养基或者培养瓶内 壁，以防止芽尖上的农杆菌污染培养基，另外茎尖接触培养基茎尖部位会分化出根组织，影 响分化。
[0140] 5)转化苗的转苗及栽苗：
[0141] 将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在 人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中。
[0142] 6)对转化苗进行抗性筛选：
[0143] 喷除草剂，对转化苗进行抗性筛选：等小苗长到两叶一心时，喷除草剂，除草剂的 喷施根据苗情来判断，筛选抗性幼苗。将将筛选得到的阳性玉米幼苗连根挖出移栽入大田。 温度在23°C-30°C，2000Lux。如图4所示，筛选的抗性植株。
[0144] 7)自交授粉：
[0145] 移入田间的植株套袋自交授粉，单穗收获。如图5所示，转化植株自花授粉后得到 的果穗。
[0146] 三、T1代检测
[0147] T0代的种子播种后，等有苗族长到两叶一心或者是三个叶片时，在最上面的叶子 中下部用棉棒涂抹除草剂，涂抹时要避开叶脉部分，每株涂抹一片叶子，涂抹时，先用记号 笔画个小圈再涂抹，所用除草剂的剂量与T0代一致，
[0148] 等除草剂见效时，就可以进行筛选，涂抹部位附近叶片发黄即可认定转化不成功， 当然会有部分叶片萎蔫或者发黄是因为机械损伤或者是光照不充分的缘故，对于不确定的 植株可以再等一段时间，等可以确认时再剔除。
[0149] 四、实验实施结果与分析
[0150] 1)p3301-CrylAC植物表达载体的PCR检测、酶切检测：提取转化后农杆菌质粒，用 设计好CrylAc引物进行PCR扩增。用NcoI和BstEII的2限制性内切酶酶切个p3301质 粒及p3301CrylAc质粒，如图1酶切结果，电泳图检测获得约560bp条带，载体P3301构建 成功。
[0151] 2)农杆菌转化玉米植株的PCR检测：提取玉米叶片DNA，用设计好CrylAc引物进 行PCR扩增。由图2可知，转化植株经PCR扩增有约560bp的条带。证明转化植株为阳性。
[0152] 3)RT-PCR检测：提取转基因玉米愈伤组织的RNA，反转录为cDNA，用RT-PCR的方 法检测Cry1AC的转录情况。如图3所示，RT-PCR结果表明，所转化的玉米植株CrylAc抗 虫基因得以转录。
[0153] 4)以玉米成熟胚茎尖作为受体免除转基因过程中的植株再生等环节整个转化周 期约2周左右可以鉴定是否转化成功，与玉米外植体组织组织培养、愈伤组织转化相比较， 大大缩短了玉米转化的周期，且过程容易鉴定，转化成本低。
[0154] 5)用农杆菌介导法转化玉米成熟胚茎尖，获得87株转化苗，经过300mgL的除草 剂（Basra)筛选，共获得43株转基因植株。进一步进行PCR检测，其中株13表现阳性，转 化率达14. 94%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。而现如今玉米平均的转化 率在5% -7%左右，也有相关报道玉米转化率达10%左右，但用农杆菌介导法转化玉米成 熟胚茎尖转化效率达14. 94%。这表明农杆菌介导法转化玉米成熟胚茎尖转化具有较高的 转化效率。
[0155] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在