制备外源功能基因定点整合的人神经干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种腺相关病毒（AAV)介导的外源功能基因在人神经干细胞中的定 点整合和基因表达，同时还涉及基因工程化人神经干细胞的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着细胞治疗和基因治疗技术的不断发展和完善，利用基因工程化细胞对病变 组织进行替代和治疗已成为医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。研究表明，神 经干细胞作为转基因载体细胞具有以下优点：①自我复制更新和多向分化潜能：NSCs是 具有增殖和分化潜能的原始神经细胞，其分化受内在基因调控（参见ShiJ，JinG，Zhu H,etal.TheroleofBrn_4intheregulationofneuralstemcelldifferentiation intoneurons[J]·NeuroscienceResearch, 2010, 67(1):8-17·)，并受所处环境（包括 细胞因子、缺血、炎症、损伤等微环境）的影响（参见DelcroixGJ，JacquartM，Lemaire L,etal.MesenchymalandneuralstemcellslabeledwithHEDP-coatedSPI0 nanoparticles:invitrocharacterizationandmigrationpotentialinrat brain[J].BrainRes, 2009, 1255:18-31);②向周围组织迀移：移植后，干细胞能向病灶移 动并分化产生新的神经细胞；③趋化性：NSCs根据所到达位置而分化为特异性的神经组织 细胞；④低免疫原性：在移植区，NSCs免疫排斥反应较轻，利于存活（参见Daadi丽，Lee SH,AracA,etal.Functionalengraftmentofthemedialganglioniceminencecells inexperimentalstrokemodel[J]·CellTransplant, 2009, 18 (7): 815-826·)。将有用 的功能基因导入人神经干细胞，由此产生了基因工程化的人神经干细胞，使人神经干细胞 的应用进一步扩大，适应不同目的的研究和治疗等的需要。比如通过外源功能基因的表达 来纠正或补救缺陷基因导致的致病因素；将调控神经干细胞定向分化的基因导入神经干细 胞，移植后使其向所需的神经功能细胞分化，达到细胞替代的作用；或者导入调控基因加快 组织重建过程，同时传递营养因子、生长因子以阻止神经细胞进一步变性坏死，起到神经保 护作用。然而目前基因工程化干细胞的载体和方法都是把外源基因随机导入到人或其他动 物的染色体上，但这样有引起基因突变，甚至诱发癌变的可能。腺相关病毒（AAV)是目前所 知的唯一能定点整合到人类细胞特定位点的基因载体。AAV定点整合的位点，人19号染色 体的AAVS1位点，已被证实是安全可靠的位点。而且整合的基因会随着细胞的复制而复制， 从而使得功能基因长期保存和高水平表达。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0004] 本发明还有一个目的是提供一种基因工程化人神经胚胎干细胞及基因工程化神 经干细胞株的制备方法，所述细胞株为定点整合有外源功能基因且能稳定表达外源功能基 因的人神经干细胞株。
[0005] 本发明通过rAAV介导外源功能基因导入人神经干细胞，定点整合在人神经干细 胞的19号染色体的AAVS1位点，从而替代弥补异常基因表达、封闭或祛除致病基因或重建 调控系统等，建立基因工程化的人神经干细胞，以纠正或补偿由于基因缺陷或异常所引起 的疾病，或赋予神经干细胞新的细胞功能。
[0006] 为实现上述目的，本发明公开了一种制备外源功能基因定点整合的人神经干细胞 的方法，通过以下步骤制得，包括：
[0007] 步骤1，外源功能基因的获得：根据外源功能基因序列设计引物，将所述引物进行 PCR扩增，将PCR产物连接至克隆载体构建外源功能基因克隆载体，对所述外源功能基因克 隆载体进行测序，测序正确后对所述外源功能基因DNA片段进行扩增；
[0008] 步骤2,外源功能基因的质粒载体构建：将步骤1扩增后的外源功能基因克隆载体 及rAAV2骨架质粒分别进行双酶切，在紫外透照仪上回收外源功能基因片段和质粒载体骨 架片段，所述外源功能基因片段及所述质粒载体骨架片段在连接酶作用下进行连接反应得 到连接产物，对连接产物进行筛选鉴定，获得含有外源功能基因的rAAV2质粒载体；
[0009] 步骤3,含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助腺相关病毒的制备： 对步骤3得到的所述含有外源功能基因的rAAV2质粒载体与包装必需的辅助质粒进行共转 染AAV293细胞，得到含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助的腺相关病毒； 以及，
[0010] 步骤4,外源功能基因定点整合的人神经干细胞的制备及定点整合鉴定：将步骤3 制得的含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助腺相关病毒以一定比例共感 染人神经干细胞，利用流式细胞仪分选得到外源功能基因定点整合的人神经干细胞，利用 巢式PCR鉴定外源功能基因定点整合于人神经干细胞19号染色体的AAVS1位点；
[0011] 步骤5,对所述外源功能基因定点整合的人神经干细胞进行功能鉴定：对筛选出 的人神经干细胞的干细胞特性、外源功能基因表达及分化能力进行分析鉴定。
[0012] 优选的是，其中，步骤1中通过基因文库查找所述外源功能基因序列及其启动子。
[0013] 优选的是，其中，所述引物包括5'引物或3'引物，所述引物中包含有酶切位点。
[0014] 优选的是，其中，步骤2中所述质粒为pTR-P5-EGFP-IRES质粒，所述质粒含有腺相 关病毒ITR完整序列。
[0015] 优选的是，其中，步骤2首先活化扩增所述pTR-P5-EGFP-IRES质粒，转化大肠杆菌 SURE2感受态，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑阳性单克隆菌于氨苄青霉素抗性的LB培养液 中，37°C恒温摇床200r/min培养16小时，抽提质粒备用，所述pTR-P5-EGFP-IRES质粒经限 制性内切酶酶切后用1%凝胶电泳进行分析鉴定。
[0016] 优选的是，其中，步骤2将鉴定正确的连接了外源功能基因的重组克隆载体及 PTR-P5-EGFP-IRES质粒分别进行双酶切，在紫外透照仪上回收外源功能基因片段和载体骨 架片段。
[0017] 优选的是，其中，步骤2中所述载体骨架片段及所述外源功能基因片段摩尔比为 1 :3,所述载体骨架片段及所述外源功能基因片段在T4DNA连接酶作用下，16°C连接反应 4h，得到连接产物，将所述连接产物转化大肠杆菌SURE2感受态，涂布LB氨苄青霉素抗性平 板，挑取单克隆，增菌抽提质粒进行筛选鉴定。
[0018] 优选的是，其中，步骤3中采用PEI转染试剂对所述rAAV质粒载体与病毒包装辅 助质粒pDG进行共转染。
[0019] 优选的是，其中，步骤4中含有外源功能基因的重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-GDNF 及定点整合辅助腺相关病毒rAAV2-SVAV2比例为30:1。
[0020] 优选的是，其中，以MOI=105的rAAV2-EGFP-GDNF感染人神经干细胞，感染72h后 开始在倒置荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达并成像，用流式细胞仪检测人神经干细胞的 感染效率，并通过分选获得表达外源功能基因的人神经干细胞。
[0021] 本发明至少包括以下有益效果：本发明通过rAAV介导外源功能基因导入人神经 干细胞，定点整合在人神经干细胞的19号染色体的AAVS1位点，以替代弥补异常基因功能、 封闭或祛除致病基因、重建调控系统等，建立基因工程化的人神经干细胞，以纠正或补偿由 于基因缺陷和异常所引起的疾病；本发明的基因工程化细胞或细胞株能够保持原有的干细 胞特性；细胞株移植后能分化成神经元细胞，并且稳定表达外源功能基因，以纠正或补偿由 于基因异常或缺陷所引起的疾病，为干细胞基因治疗提供一种可行的方法，且赋予神经干 细胞新的细胞功能。
[0022] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例所述的rAAV2-EGFP-GDNF和rAAV-SVAV2共感染人神经干细 胞的感染效率示意图；
[0024] 图2为本发明实施例所述的人神经干细胞19号染色体AAVS1位点定点整合外源 功能基因的PCR检测图谱（泳道1、3为未感染病毒的人神经干细胞的PCR产物；泳道2、4 为病毒共感染后人神经干细胞的PCR产物）；
[0025] 图3a为本发明实施例所述的人神经干细胞19号染色体AAVS1位点定点整合PCR 产物测序blast结果谱图一；
[0026] 图3b为本发明实施例所述的人神经干细胞19号染色体AAVS1位点定点整合PCR 产物测序比对结果谱图二；
[0027] 图3c为本发明实施例所述的人神经干细胞19号染色体AAVS1位点定点整合PCR 产物测序比对结果谱图三；
[0028] 图4为本发明实施例所述的Western-Blot检测人神经干细胞⑶NF的表达图谱 (泳道1为未经病毒感染的人神经干细胞培养15天后的细胞裂解液；泳道2为病毒感染后 人神经干细胞培养15天后的细胞裂解液；泳道3为未经病毒感染的人神经干细胞培养180 天后细胞裂解液；泳道4为病毒感染后神经干细胞培养180天的细胞裂解液；泳道5为空载 病毒感染人神经干细胞裂解液对照）；
[0029] 图5为本发明实施例所述的rAAV2感染前后人神经干细胞干性的RT-PCR鉴定结 果图谱（泳道1、3、5、7表示病毒感染前细胞RNA的RT-PCR产物，泳道2、4、6、8表示病毒感 染后细胞RNA的RT-PCR产物）；
[0030] 图6为本发明实施例所述的移植的人神经干细胞体内β-mtubulin抗体免疫荧 光染色谱图（图A表示细胞表达EGFP，图B表示β-IIItubulin抗体免疫荧光染色，图C表 不两种焚光置加）。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0032] 应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0033] 本发明通过构建一种高效表达外源功能基因的质粒载体，然后用此质粒包装的重 组腺相关病毒（rAAV)和辅助定点整合的rAAV以一定比例共感染人神经干细胞，进一步通 过筛选获得外源功能基因定点整合于19号染色体AAVS1位点的人神经干细胞。具体包括 以下步骤：
[0034] (1)外源功能基因获得：通过基因文库查找外源功能基因序列及其启动子，根据 外源功能基因序列设计引物（5'引物、3'引物，加酶切位点），经PCR扩增后得到PCR产物， 将所述PCR产物连接克隆载体，构建外源功能基因克隆载体，测序正确后扩增外源功能基 因的DNA片段。
[0035] (2)重组表达质粒载体构建及鉴定：
[0036] 首先活化扩增PTR-P5-EGFP-IRES质粒，转化大肠杆菌SURE2感