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【主权项】
1. 一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法，其特征在于，包括如下步骤： A、 玉米茎尖培养及载体构建： 1) 挑选饱满无损伤的种子，进行消毒处理后，取成熟胚放于萌发培养基上，在培养箱中 经过低温处理，再置于23-28Γ暗培养进行萌发； 2) 构建携带目的基因的植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌； B、 利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化： 1) 玉米成熟胚茎尖的获取： 待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方l-2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉丢 弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位向下纵切第二刀，切口稍越过结的下线约1_，用刺 针刺伤横切面生长点上端，在高渗培养基中放置lh以上； 2) 茎尖的侵染： 从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖4-6min ; 3) 茎尖和根癌农杆菌的共培养： 取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养基上 在24-28 °C共培养3d ; 4) 茎尖的恢复培养： 将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24Γ下培养至从生长点部位萌生出新的幼 叶； 5) 转化苗的转苗及栽苗： 将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在人工 气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中； 6) 对伸展出新生叶的幼苗进行抗性筛选： 幼苗长到两叶一心时，用除草剂处理新生叶片，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛选抗 性幼苗，将正常生长的玉米幼苗连根挖出移栽入大田； 常规方法在转苗前惊醒筛选培养，而成熟胚茎尖转化是转化的生长点，所以幼苗长到 两叶一心时，才能用除草剂处理新生叶片。 所述萌发培养基为：33000mg/L NH4N03,38 0 00mg/L KN03,88 00mg/L CaCl2.2H20，7400mg/L MgS04.7H20,3400mg/L KH2P04,4400mg/L MnS04.4H20,800mg/L H2B03，1600mg/ L KI，1600mg/L ZnS04·7H20,4. 88 5mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L核黄素，5. 008mg/L生物素， 2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素BI，5. Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸 吡哆辛，〇·〇〇675mg/L维生素Β12,2· 47mg/L对氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA. 2Η20,5· 56mg/L FeS04. 7H20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L鹿糖，5000mg/L葡萄糖， 100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉pH 5. 8 ; 所述高渗培养基：56600mg/LKN03,9 2 60mg/LNH4S04,3 7 00mg/LMgS04.7H20,8000mg/LKH2P04,33200mg/LCaCl· 2H20,lOOmg/LMnS04 · 4H20,20mg/LZnS04 · 7H20,0 · 25mg/L CoCl2 ·6Η20,0· 25mg/LCuS04 ·5Η20,2· 5mg/LNaMo04 ·2Η20,4· 885mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L 核黄素，5. 008mg/L生物素，2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素ΒΙ，5·Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸吡哆辛，0· 00675mg/L维生素Β12,2· 47mg/L对氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA ·2Η20, 5. 56mg/L FeS04 ·7Η20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/L L-脯氨酸，20000mg/ L鹿糖，10000mg/L葡萄糖pH 5·8 ; 所述浸染培养基为：56600mg/L KN03,9260mg/L NH4S04,3 7 00mg/LMgS04·7Η20，8000mg/LKH2P04,33200mg/LCaCl · 2H20,100mg/LMnS04. 4H20,20mg/LZnS04 · 7Η20,0· 25mg/ LCoC12·6H20,0· 25mg/LCuS04·5H20, 2. 5mg/LNaMo04·2H20,4. 885mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L 核黄素，5. 008mg/L生物素，2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素ΒΙ，5· Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸吡哆辛，0· 00675mg/L维生素Β12,2· 47mg/L对氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA ·2Η20, 5. 56mg/L FeS04 ·7Η20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，20000mg/ L鹿糖，10000mg/L葡萄糖，100uM乙酰丁香酮pH 5. 8 ; 所述共培养固体培养基为：33000mg/L NH4N03,38 0 00mg/L KN03,88 00mg/L CaCl2,2H20，7400mg/L MgS04.7H20,3400mg/L KH2P04,4400mg/L MnS04.4H20,800mg/L H2B03，1600mg/ L KI，1600mg/L ZnS04·7H20,4. 88 5mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L核黄素，5. 008mg/L生物素， 2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素BI，5. Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸 吡哆辛，〇·〇〇675mg/L维生素B12, 2. 47mg/L对氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA·2H20, 5. 56mg/ L FeS04·7H20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L鹿糖，5000mg/L葡萄 糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉，100uM乙酰丁香酮pH 5· 8 ; 所述恢复培养基为：1/2MS培养基，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，8000mg/L琼脂 粉。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理包括具体为：将挑选好的饱 满无损伤的种子在超净工作台上消毒两遍： 第一遍：用70%的乙醇灭菌8分钟，0.1%的升汞水溶液灭菌六分钟，无菌水洗涤三次： 第一次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第二次3倍种子体积无菌水洗2-3分钟，第三次2 倍种子体积的无菌水洗涤一分钟，然后加1. 5倍种子体积的无菌水24-26Γ浸泡种子6小时 (若温度过高，可适当的缩短时间），泡的时间一定要把握好，时间太久的话种子容易发黑， 萌发出牙率降低； 第二遍：用0. 1 %的升汞水溶液灭菌10分钟，无菌水洗涤五次，第一次1倍种子体积无 菌水洗涤1分钟，第二次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第三次3倍种子体积无菌水洗涤 2-3分钟，第四次2倍种子体积无菌水洗涤5分钟，第五次0. 5倍种子体积无菌水洗涤一分 钟，灭菌完毕，放入萌发盒。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟胚的萌发过程为：将消毒后的种 子取成熟胚，盾片向下置于萌发培养基上，在4°C暗培养12h，再转入到15°C条件下暗培养 24h，此时胚开始萌发，然后转移到28°C暗培养2天。（低温处理以利于种子萌发的一致性， 同时低温处理以利于提高生长组织的分化率，时间可以自由调节，与后续的农杆菌培养的 浓度达到一致。以在农杆菌最适的生长时期侵染茎尖，以提高转化的效率。）4. 根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为含有抗虫 基因的植物表达载体。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为含有Cry1AC抗虫基 因的植物表达载体。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，含有Cry1AC抗虫基因的植物表达载体的 构建方法为：利用PCR扩增技术获得Cry1AC抗虫基因，利用限制性内切酶酶切切除P3301 载体质粒中的GUS基因，用T4连接酶将CrylAc抗虫基因连接到酶切后的P3301载体质粒 中，构建P3301-CrylAc抗虫植物表达载体。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述P3301-CrylAc抗虫植物表达载体的 构建方法包括如下步骤： (1) 18-T-CrylAc载体用限制性内切酶Ncol和BstEII双酶切，电泳回收大片段； (2)p3301载体用限制性内切酶Ncol和BstEII双酶切，电泳回收大片段； (3) 将步骤（2)电泳回收的线性化p3301载体和步骤⑴电泳回收的CrylAc片段用 T4连接酶连接； (4) 将连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，采用双酶切鉴定筛选阳性重组载体。 (如图1所示，电泳图检测获得约560bp条带，载体P3301构建成功。）8. 权利要求1~7任一项所述的方法在制备转基因玉米中的应用。
【专利摘要】本发明涉及转基因玉米，具体公开了一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法。本发明利用玉米茎尖作为受体不受基因型的限制，还开发了一套严格适用于玉米茎尖作为转化受体的培养基体系，实现玉米的高效遗传转化。本发明所述方法缩短了玉米的转化周期，以茎尖作为受体不受基因型的限制，还可以免除转基因过程中的植株再生等环节。突破了转化外植体的限制，提高了玉米的转化效率。该方法操作简便，简单易行，转化周期短，转化效率高，结果可靠，能够快速获取转基因玉米植株。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN105420274
【申请号】CN201510891700
【发明人】康定明, 刘永健, 曹金伶, 张少蔓, 赵传森, 严慧慧
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月7日