一种聚酰胺-胺超支化基因载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及聚酰胺-胺基因载体技术领域，尤其涉及一种聚酰胺-胺超支化基因 载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着合成化学的迅速发展，许多新的分子结构可设计探讨聚合物拓扑结构，超支 化聚合物由于其独特的结构和物理化学性质已成为当前的一个研究热点；超支化聚合物广 泛应用于生物传感、相分离、电池能源、基因传递、药物运载、水凝胶、光催化剂载体及生物 医学等，因超支化聚合物特殊的三维立体的结构特点，可由两发散和收敛两种方法合成。超 支化聚合物因为具有独特的物理和化学特性，如低粘度，高溶解度，高相容性，高反应性，超 支化聚合物越来越得到科学家的密切关注。在过去的几十年里大量的研究都集中在超支化 聚合物。
[0003] 目前超支化聚合物正在成为新一代的基因传递的非病毒载体，在基因传递的非病 毒载体中，超支化聚合物具有两个鲜明的特点：一是结构可控，一是化学性能可适应各种要 求如药物或基因传递。在过去的几年超支化聚合物的制备已经得到了相当大的关注。非病 毒基因载体特别是阳离子聚合物也受到越来越多的关注。目前的阳离子聚合物聚酰胺-胺 支化程度较差，用作基因载体时毒性大，且缓冲能力差，原料成本较高。
【发明内容】
[0004] 本发明提出了一种聚酰胺-胺超支化基因载体及其制备方法和应用，支化程度 好，用作基因载体时毒性小，缓冲能力好，可用作抗癌治疗，原料成本低，制备方法简单。
[0005] 本发明提出的一种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括A物料、B物料、C物料 及三乙胺；
[0006] A物料分子式为：C2(n1}H5n2Nn，其中η= 2, 3, 4, 5 ;
[0007]C物料结构式为
其中η= 0, 1，2, 3, 4, 5, 6，R= (；Η2ηι+1，πι= 1, 2, 3, 4, 5 ；
[0008] Β物料结构式为
其中η= 1，2, 3, 4, 5, 6 ;或
[0009]
其中x=y= 1，2, 3, 4, 5, 6。
[0010] 物料A有两个作用，一个是氨解作用，一个对末端烯烃通过迈克尔加封端。
[0011] 优选地，A物料由乙二胺、三乙四胺及分子量为250-300的多乙烯多胺的一种或两 种以上组成，B物料为Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺，C物料为L-半胱氨酸甲酯盐酸盐。
[0012] 优选地，Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为 2-4:1-3,N，f-亚甲基双丙烯酰胺与Α物料的摩尔比1:80-120。
[0013] 优选地，还包括溶剂，溶剂按体积份包括水1-6份，DMS0 0-5份。
[0014] 优选地，B物料与溶剂的重量体积比g:ml为0. 2-0. 8:4-8。
[0015] 优选地，其原料还包括环糊精、水及DMS0,水与DMS0的体积比为2-12:1-10 ;优选 水与DMS0的混合物与B物料的体积重量比ml:g为4-8:0. 2-0. 8。
[0016] 本发明还公开了一种聚酰胺-胺超支化基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0017] 将B物料、C物料、三乙胺及溶剂送入反应器进行聚合反应，其反应温度为 55-65 °C，反应时间为30-40h，加入A物料进行氨解，氨解温度为55-65 °C，氨解时间为34-52 小时，得到聚酰胺-胺超支化基因载体。
[0018] 本发明还公开了一种聚酰胺-胺超支化基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0019] 称取40-60wt%DMS0,向其中加入B物料溶解完全得到第一溶液，将水与剩余的 DMS0混合均匀，向其中加入C物料溶解完全，加入环糊精至饱和得到第二溶液，将第一溶液 滴加至第二溶液中，滴加完全后加入三乙胺，升温至52-62°C反应32-38h，加入A物料进行 氨解反应，氨解温度为50-60°C，氨解时间为36小时，透析得到聚酰胺-胺超支化基因载体； 优选，透析使用的透析膜的分子量为3000-14000。
[0020] 优选地，氨解反应后，还包括浓缩，纯化；优选地，浓缩过程在旋转蒸发仪中进行； 在纯化过程中，向浓缩得到的物料中加入冷丙酮和/或醚进行沉淀，过滤，向得到的沉淀物 中加入蒸馏水溶解，继续加入冷丙酮和/或醚进行沉淀，依次重复3-5次。
[0021] 本发明还公开了一种聚酰胺-胺超支化基因载体作为基因载体用于抗癌治疗的 应用。
[0022] 本发明所述聚酰胺-胺超支化基因载体的原料易得，成本低，通过合理控制原料 中各组分间的比例，生成含多氨基的聚酰胺-胺超支化基因载体，其支化度较好；另外通 过采用一步法制备具有不同支化度且具有相同的重复单元和类似分子量的制品，制备过程 有效且方法简单，在具体制备过程中，首先利用C物料、B物料在三乙胺催化下进行反应得 到物料有较好的生物相容性及较低的细胞毒性，其次进一步加入A物料氨解后得到的聚酰 胺-胺超支化基因载体拥有不同于普通基因载体的三维立体结构，可以更好地与DNA复合 得到更加优异的体内体外转染效率，进一步添加的环糊精，可有效控制聚酰胺-胺超支化 基因载体的支化结构；所述制品用作基因载体时，对细胞的毒性小，缓冲能力好，具有优异 的DNA复合压缩能力，且原料易得，成本较低，可广泛应用于抗癌治疗，大幅降低抗癌药的 成本，为大众群体所接受。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的支链的分子结构示意图；
[0024] 图2为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的二维核磁谱图1H-i-COSY;
[0025] 图3为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的一维核磁谱图13C_NMR;
[0026] 图4为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的不同超支化分子的支化度；
[0027] 图5为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的凝胶渗透色谱分析表；
[0028]图6为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的水合流体力学半径及其Zeta 电位图；
[0029] 图7为本发明提出的聚酰胺-胺超支化基因载体的红外谱图；
[0030] 图8为本发明提出的氨解后的聚酰胺-胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0031] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0032] 实施例1
[0033] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括A物料，B物料，C物料及三乙胺；
[0034]A物料分子式为：C2(n1}H5n2Nn，其中η= 2, 3, 4, 5;
[0035]C物料结构式为
其中η= 0, 1，2, 3, 4, 5, 6，R= (；Η2ηι+1，πι= 1, 2, 3, 4, 5 ；
[0038] 实施例2
[0039] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺，L-半胱 氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，三乙四胺及水。
[0040] A物料可以为乙二胺、三乙四胺或分子量为250-300的多乙烯多胺。
[0041]Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为3:2.4,N， Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与三乙四胺的摩尔比1:80。Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与溶剂水 的重量体积比g:ml为0. 8:4。
[0042] 实施例3
[0043] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺、L-半胱 氨酸甲酯盐酸盐、三乙胺、分子量为275的多乙烯多胺及溶剂。
[0044] Ν，V-亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为2. 5:2. 9,Ν， Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与多乙烯多胺的摩尔比1:120。Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与溶剂 的重量体积比g:ml为0. 2:8。溶剂按体积份包括水1份，DMS0 5份。
[0045] 实施例4
[0046] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺，L-半胱 氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，乙二胺，及溶剂。
[0047] N，f -亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为2:3，N，f -亚 甲基双丙烯酰胺与乙二胺的摩尔比1:95。N，N'-亚甲基双丙烯酰胺与溶剂的重量体积比g:ml为0.6:5。溶剂按体积份包括水5份，DMSO1份。
[0048] 所述的聚酰胺-胺超支化基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0049] 将N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、三乙胺及溶剂送入反应器 进行聚合反应，其反应温度为55°C，反应时间为40h，加入乙二胺氨解，氨解温度为55°C，氨 解时间为52小时，得到聚酰胺-胺超支化基因载体。
[0050] 实施例5
[0051] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺，L-半胱 氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，三乙四胺，及溶剂。
[0052]Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为3:2.5,Ν， Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与三乙四胺的摩尔比1:115。Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与溶剂的 重量体积比g:ml为〇. 3:8。溶剂按体积份包括水4份，DMS0 2份。
[0053] 所述的聚酰胺-胺超支化基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[0054] 将N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、三乙胺及溶剂送入反应器 进行聚合反应，其反应温度为65°C，反应时间为30h，加入三乙四胺氨解，氨解温度为65°C， 氨解时间为34小时，得到聚酰胺-胺超支化基因载体。
[0055] 实施例6
[0056] -种聚酰胺-胺超支化基因载体，其原料包括Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺，L-半胱 氨酸甲酯盐酸盐，三乙胺，分子量为275多乙烯多胺，及溶剂。
[0057]Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为3:2，N，f-亚 甲基双丙烯酰胺与分子量为275多乙烯多胺的摩尔比1:100。Ν，Ν'-亚甲基双丙烯酰胺 与溶剂的重量体积比g:ml为0. 45:6。溶剂按体积份包括水3份，DMS0 3份。
[0058] 所述的聚酰胺-胺超支化基因载体的制备方法，包括如下步骤：
[005