用于制备交联的透明质酸产物的方法
【专利说明】用于制备交联的透明质酸产物的方法 发明领域
[0001]本发明涉及多糖的领域。更具体地，本发明涉及将透明质酸(HA)交联和制造交联 的HA产物的新的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 用于医学用途的最广泛使用的生物相容聚合物中的一种是透明质酸(HA)。它是天 然存在的多糖，属于糖胺多糖(GAG)的组。HA和其他GAG是带有阴性电荷的杂多糖链，其具有 吸收大量水的能力。HA和衍生自HA的产物在生物医学领域和整容领域中被广泛地使用，例 如在粘性手术期间和作为皮肤填充剂。
[0004] 吸水凝胶或水凝胶广泛地被用于生物医学领域。它们通常通过使聚合物化学交联 成无限网络来制备。尽管天然的HA和某些交联的HA产物吸收水直到它们完全被溶解，然而 交联的HA凝胶通常吸收某些量的水直到它们被饱和，即它们具有有限的液体保持能力或溶 胀度。
[0005] 因为在大部分活的有机体中，HA除了其分子量之外以相同的化学结构存在，所以 它给出最少的反应并且允许高级的医学用途。HA分子的交联和/或其他改性是改进其体内 耐降解性或耐久性所必需的。此外，这样的改性影响HA分子的液体保持能力。作为其结果， HA已经是许多改性尝试的主题。
[0006] 当从生物相容的聚合物制备凝胶时，有利地是确保低的交联度以便保持高的生物 相容性。然而，常需要更致密的凝胶以具有合适的生物医学效果，并且在这样的情况下生物 相容性将常被损失。
[0007] 涉及植入物的一些已知的软组织填充治疗偶尔遭受植入物或其部分从合意的治 疗部位移开的缺点。
[0008] WO 87/07898公开用于制备HA膜的方法。应避免任何凝胶形成直到交联步骤，其包 括将环氧活化的HA的水溶液干燥成膜。在该方法中固有的是在交联步骤中的所有其他组分 必须是挥发性的。
[0009] WO 2004/092223公开在大体上不除去环氧化物下，通过干燥HA和环氧化物交联剂 的混合物产生交联的HA凝胶的方法。
[0010] 同样地，WO 2011/109129和WO 2011/109130公开在交联剂的存在下在非变性条件 下通过干燥HA产生HA线状物的工艺。
[0011] US 5,827,937公开用于制备具有高的交联度的多糖的工艺。
[0012] WO 00/046253公开包括两种类型的交联步骤的方法，每一种均在交联剂的存在 下，用于提高HA的交联度。
[0013] US 2007/0066816公开用于制备双交联的HA的工艺，其包括在两个步骤中分别用 环氧化物和碳化二亚胺交联HA底物。
[0014] US 6，852，255公开包括交联HA的水溶液随后使交联的HA成型的方法，使交联的HA 成型例如通过有机溶剂的添加以沉淀交联的HA。
[0015] US 4,716,224涉及用于产生对酶分解具有提高的抵抗性的交联的HA的方法。它提 及HA可以在交联剂的添加之前被沉淀。
[0016] KR 2007/0004159公开通过使HA在固相中经受在有机溶剂中的交联剂来制备交联 的HA的方法。
[0017] EP 2199308涉及通过在交联剂的添加之前将HA粉末分散在含水乙醇中产生交联 的HA的方法。
[0018] US 6,921，819公开用于交联HA的方法，其中将多官能交联剂在其水合期间与固态 的HA反应。
[0019] 尽管本领域中的这些进展，然而仍旧需要制造具有合适的液体保持能力和降解分 布，但又具有保留的生物相容性的交联的HA产物的可选的方法。特别地，合意的是，使获得 具有合意的凝胶强度(例如其可以作为液体保持能力被测量）的HA凝胶产物所需要的改性 度最小化。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明的目的是提供用于制造交联的透明质酸(HA)产物的新的方法，其满足以下 要求的一个或更多个：
[0022]-交联剂的低的并入
[0023]-有限的副反应，例如与周围介质和卤化物离子的有限的副反应
[0024]-受控的反应条件
[0025]-良好的工艺重复性
[0026]-适于按比例放大至工业工艺
[0027]-有限的总工艺时间
[0028] -足够的凝胶强度以抵抗植入时的变形和移动
[0029] -允许在方法步骤中使用多种类型的剂(例如，缓冲剂、碱、酸、盐）。
[0030] 为实现由本说明书明显的这些目标和/或其他目标，已经意识到，本发明的潜在目 的是提供用于制造交联的HA产物的方法，该交联的HA产物具有低的至中等的改性度 (degree of modification)，而同时具有如通过低的至中等的液体保持能力（liquid retention capacity)或溶胀度（swelling degree)示出的高的凝胶强度。
[0031] 本发明提供通过控制对于具体的交联剂与HA的改性效率，即控制在产生合意的强 度的凝胶中交联程序的效率，多方面控制HA交联方法。本发明因此允许用令人惊讶地低的 HA化学改性制造具有合意的强度(有限的溶胀度）的凝胶。这是有利的，以便使生物相容性 问题最小化，但通常还改进了 HA交联工艺的控制。
[0032] 本发明的目的还是提供用于制造交联的HA产物的方法，其中高比例的结合的交联 剂在(至少)两端被连接，即以实现高的交联效率。
[0033] 本发明的另外的目的是提供具有低的至中等的改性度并且同时低的至中等的液 体保持能力(或溶胀度)的交联的HA产物。
[0034]本发明的目的是提供对变形具有高的抵抗性的交联的HA产物。
[0035]对于将由本公开内容明显的这些目的和其他目的，根据第一方面，本发明提供用 于制造交联的透明质酸(HA)产物的方法，所述方法包括：（a)通过使HA与一种或更多种多官 能的交联剂在水溶液中反应来开始HA的交联以获得活化的HA; (b)将未反应的交联剂从活 化的HA中除去；以及(c)通过在不添加任何另外的交联剂下，使活化的HA经受另外的交联条 件，完成活化的HA的交联以获得交联的HA产物;其中完成交联步骤(c)在液体沉淀介质和沉 淀形式的活化的HA的悬浮液中进行。
[0036] 此方法提供最终交联步骤的良好的控制，因为它仅发生在固体(沉淀)相中。获得 的产物独特在于，尽管具有低的HA的改性度，它是具有低的溶胀度的凝胶。令人高度惊讶 地，具有有限的溶胀度的凝胶产物完全可以获得为具有这样低的改性度。
[0037] 在根据本发明的方法的一种实施方案中，除去步骤(b)包括：（bl)使活化的HA在液 体沉淀介质中沉淀以获得包含液体沉淀介质和沉淀形式的活化的HA的悬浮液；以及(b2)将 未反应的交联剂从沉淀的、活化的HA的悬浮液中除去。任选地，除去子步骤(b2)包括用液体 沉淀介质洗涤沉淀的、活化的HA。从沉淀形式的活化的HA中除去交联剂是有利的，因为它迅 速产生非常清洁的中间体产物，即不具有仍旧未反应的交联剂。此交联剂移除步骤在大规 模工艺中也是非常有用的。
[0038] 在根据本发明的方法的另一种实施方案中，完成交联步骤(c)包括：（cl)使活化的 HA在液体沉淀介质中沉淀以获得包含液体沉淀介质和沉淀形式的活化的HA的悬浮液；以及 (c2)通过在不添加任何另外的交联剂下，使沉淀的、活化的HA的悬浮液经受另外的交联条 件，完成活化的HA的交联以获得交联的HA产物。
[0039]在根据本发明的方法的某些实施方案中，液体沉淀介质包含大于65wt%的水溶性 有机溶剂，并且优选地70_80wt%的水溶性有机溶剂和20-30wt%的水。
[0040] 在根据本发明的方法的某些实施方案中，水溶性有机溶剂包含一种或更多种低级 烷基醇或者是由一种或更多种低级烷基醇组成，并且优选地乙醇。
[0041] 在根据本发明的方法的特定的实施方案中，开始交联步骤(a)提供凝胶形式的活 化的HA。此凝胶形式有助于下游步骤，例如处理、成型、洗涤和沉淀。
[0042]在根据本发明的方法的某些实施方案中，交联剂选自由二乙烯砜、多环氧化合物 和双环氧化合物组成的组。交联剂的优选的组由1，4_丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1，2_乙 二醇二缩水甘油醚（EDDE)和二环氧辛烷组成，并且特别是1，4_丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE) 0
[0043] 在根据本发明的方法的特定的实施方案中，该方法还包括以下步骤：（d)使来自步 骤(c)的沉淀的、交联的HA产物经受非沉淀条件；以及(e)将非沉淀形式的交联的HA产物分 离。
[0044] 在根据本发明的方法的某些实施方案中，该方法还包括将交联的HA产物灭菌的步 骤。
[0045]根据第二方面，本发明提供具有0.35或35 %或更高、并且优选地在35-80 %例如 40-80%或50-80%的范围内的有效交联剂比（effective cross-linker ratio)的交联的 HA产物。有效交联剂比（CrR)描述已经结合两个(或更多个)二糖(仅HA-X-HA)的总结合的交 联剂(HA-X-HA和HA-X)的比例，其中X是交联剂。有效交联剂比可以例如通过在HA凝胶的酶 催化降解之后的LC-MS来确定。作为一个例子，有效交联剂比的确定可以，例如使用来自金 黄节杆菌（Arthrobacter aurescens)的软骨素酶AC或来自普通变形杆菌（Proteus vulgaris)的软骨素酶ABC，将HA凝胶酶催化降解成由主要二糖（Adi-HA)组成的片段和包 含1-8个二糖的具有结合的交联剂(HA-X)的片段之后使用LC-MS通过HA-X片段的确定来做 出。然后，片段可以采用尺寸排阻色谱法(SEC)被分离，以及采用质谱法(MS)被检测。采用在 (Kenne等人，Carbohydrate Polymers91 (2013)410-418)中概述的原则并且在LC-MS取得方 法中针对所使用的特定的交联剂校正/修正HA-X片段和HA-X-HA片段的质量，该方法可以容 易地适于任何多官能的交联剂。
[0046]在根据本发明的交联的HA产物的某些实施方案中，产物具有每克HA 4-500mL的溶 胀度，并且优选地每克HA 15-300mL的溶胀度。
[0047]根据第三方面，本发明提供包含根据本发明的交联的HA产物、以及任选地缓冲剂 和/或张度剂(tonicity agent)的含水组合物。
[0048]根据第四方面，本发明提供预填充的注射器，该预填充的注射器用根据本发明的 交联的HA产物或其含水组合物来预填充。
[0049]根据第五方面，本发明提供根据本发明的交联的HA产物或其含水组合物在整容手 术例如皮肤填充、体形塑造和面部塑造中，在医学手术例如皮肤填充、体形塑造、组织粘连 的预防、通道的形成、失禁治疗、和矫形外科应用中，以及用于使皮肤保湿(hydrating)和/ 或使皮肤有生机的用途。
[0050]根据第六方面，本发明提供经历整容手术或医学手术的受试者的治疗的方法，包 括将根据本发明的交联的HA产物或其含水组合物施用于需要其的受试者。
[0051 ] 附图简述
[0052]图1示出用于交联HA的示意图方法。
[0053]图2示出用于交联HA的方法的示意图的延续。
[0054]图3示出在最终交联步骤中，不同的反应时间和反应温度的HA颗粒的有效交联剂 比（CrR)。
[0055]图4示出交联的HA凝胶的热诱导的降解。
[0056]图5示出交联的HA凝胶的过氧自由基诱导的降解。
[0057] 实施方案的编号清单
[0058] 1. 一种用于制造交联的透明质酸(HA)产物的方法，所述方法包括
[0059] (a)通过使HA与一种或更多种多官能交联剂在水溶液中反应来开始HA的交联以获 得活化的HA;
[0060] (b)将未反应的交联剂从所述活化的HA中除去；以及
[0061] (c)通过在不添加任何另外的交联剂下，使所述活化的HA经受另外的交联条件完 成所述活化的HA的交联以获得交联的HA产物;其中所述完成交联步骤(c)在液体沉淀介质 和沉淀形式的所述活化的HA的悬浮液中进行。
[0062] 2.根据实施方案1所述的方法，其中除去步骤(b)包括：
[0063] (bl)使所述活化的HA在液体沉淀介质中沉淀以获得包含所述液体沉淀介质和沉 淀形式的所述活化的HA的悬浮液；以及
[0064] (b2)将未反应的交联剂从沉淀的、活化的HA的所述悬浮液中除去。
[0065] 3.根据实施方案2所述的方法，其中除去子步骤(b2)包括用液体沉淀介质洗涤所 述沉淀的、活化的HA。
[0066] 4.根据实施方案1所述的方法，其中所述完成交联步骤(c)包括：
[0067] (cl)使所述活化的HA在液体沉淀介质中沉淀以获得包含所述液体沉淀介质和沉 淀形式的所述活化的HA的悬浮液；以及
[0068] (c2)通过在不添加任何另外的交