联剂下，使沉淀的、活化的HA的所述悬浮液经受 另外的交联条件，完成所述活化的HA的交联以获得交联的HA产物。
[0069] 5.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述液体沉淀介质包含大于65wt%的 水溶性有机溶剂。
[0070] 6.根据实施方案5所述的方法，其中所述液体沉淀介质包含70_80wt %的水溶性有 机溶剂和20_30wt%的水。
[0071] 7.根据实施方案5-6中任一项所述的方法，其中所述水溶性有机溶剂包括一种或 更多种低级烷基醇。
[0072] 8.根据实施方案7所述的方法，其中所述水溶性有机溶剂是乙醇。
[0073] 9.根据任一前述实施方案所述的方法，其中在所述完成交联步骤(C)中的所述悬 浮液具有9或更高的pH。
[0074] 10.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述完成交联步骤(c)在10-50°C的 温度发生。
[0075] 11.根据任一前述实施方案所述的方法，其中在开始交联步骤(a)中的所述溶液具 有9或更高的pH。
[0076] 12.根据任一前述实施方案所述的方法，其中开始交联步骤(a)在10_55°C的温度 发生。
[0077] 13.根据任一前述实施方案所述的方法，其中开始交联步骤(a)提供凝胶形式的活 化的HA。
[0078] 14.根据任一前述实施方案所述的方法，包括在步骤（c)中最终交联之前的步骤 (a)中所获得的活化的HA的合意形状的制备。
[0079] 15.根据实施方案14所述的方法，其中步骤(a)中所获得的活化的HA的合意形状的 制备发生在步骤(b)中将未反应的交联剂从所述活化的HA中除去之前。
[0080] 16.根据实施方案14-15中任一项所述的方法，其中所述合意的形状是具有0.1-5. Omm大小的颗粒。
[0081] 17.根据实施方案14-15中任一项所述的方法，其中所述合意形状是绳、网或膜。
[0082] 18.根据实施方案17所述的方法，其中所述合意形状是绳，所述绳具有5:1或更高 的在其长度和其宽度之间的比。
[0083] 19.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述交联剂选自由二乙烯砜、多环氧 化合物和双环氧化合物组成的组。
[0084] 20.根据实施方案19所述的方法，其中所述交联剂选自由1，4-丁二醇二缩水甘油 醚(BDDE)、1，2_乙二醇二缩水甘油醚(EDDE)和二环氧辛烷组成的组。
[0085] 21.根据实施方案20所述的方法，其中所述交联剂是1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE)0
[0086] 22.根据任一前述实施方案所述的方法，还包括以下步骤：
[0087] (d)使来自步骤(c)的沉淀的、交联的HA产物经受非沉淀条件；以及
[0088] (e)将非沉淀形式的所述交联的HA产物分离。
[0089] 23.根据任一前述实施方案所述的方法，包括将所述交联的HA产物灭菌的步骤。
[0090] 24.-种交联的HA产物，具有35 %或更高的有效交联剂比。
[0091] 25.根据实施方案24所述的交联的HA产物，具有在35-80 %的范围内的有效交联剂 比。
[0092] 26.根据实施方案24-25中任一项所述的交联的HA产物，具有每克HA 4-500mL的溶 胀度。
[0093] 27.根据实施方案26所述的交联的HA产物，具有每克HA 15-300mL的溶胀度。
[0094] 28.-种交联的HA产物，通过根据实施方案1-23中任一项所述方法制备。
[0095] 29.根据实施方案24-27中任一项所述的交联的HA产物，通过根据实施方案1-23中 任一项所述方法制备。
[0096] 30.根据实施方案24-29中任一项所述的交联的HA产物，其中所述HA产物具有具有 0.1 -5. Omm的大小的颗粒的形状。
[0097] 31.根据实施方案24-29中任一项所述的交联的HA产物，其中所述HA产物具有绳、 网、或膜的形状。
[0098] 32.根据实施方案31所述的交联的HA产物，其中所述形状是绳，所述绳具有5:1或 更高的在其长度和其宽度之间的比。
[0099] 33.根据实施方案24-32中任一项所述的交联的HA产物，其中所述HA产物是以干燥 的形式。
[0100] 34. -种含水组合物，包含根据实施方案24-32中任一项的交联的HA产物、以及任 选地缓冲剂和/或张度剂。
[01 01 ] 35.根据实施方案34所述的含水组合物，还包含一种或更多种医学化合物。
[0102] 36.根据实施方案35所述的含水组合物，所述医学化合物选自由局部麻醉药、抗炎 药物、抗生素、和骨生长因子组成的组。
[0103] 37.根据实施方案36所述的含水组合物，所述医学化合物包括利多卡因盐酸盐。
[0104] 38.根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任 一项所述的含水组合物在整容手术中的用途，所述整容手术例如皮肤填充、体形塑造和面 部塑造。
[0105] 39.根据实施方案38所述的用途，其中所述整容手术是面部塑造。
[0106] 40.根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任 一项所述的含水组合物用于使皮肤保湿和/或有生机的用途。
[0107] 41.根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任 一项所述的含水组合物用作药物或医学装置。
[0108] 42.根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任 一项所述的含水组合物，用于整容手术比如皮肤填充、体形塑造和面部塑造中或医学手术 例如皮肤填充、体形塑造、组织粘连的预防、通道的形成、失禁治疗、以及矫形外科应用中。
[0109] 43.根据实施方案42所述的交联的HA产物，其中所述整容手术是面部塑造。
[0110] 44.根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任 一项所述的含水组合物在制造用于整容手术比如皮肤填充、体形塑造和面部塑造中或医学 手术例如皮肤填充、体形塑造、组织粘连的预防、通道的形成、失禁治疗、以及矫形外科应用 中的药物或医学装置中的用途。
[0111] 45.根据实施方案44所述的用途，其中所述整容手术是面部塑造。
[0112] 46.-种预填充的注射器，其用根据实施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物 或根据实施方案34-37中任一项所述的含水组合物来预填充。
[0113] 47. -种治疗经历整容手术或医学手术的受试者的方法，所述方法包括将根据实 施方案24-33中任一项所述的交联的HA产物或根据实施方案34-37中任一项所述的含水组 合物施用于需要其的受试者。
[0114] 48.根据实施方案47所述的方法，其中所述整容手术是面部塑造。
[0115] 发明详述
[0116]根据第一方面，本发明提供用于制造交联的透明质酸(HA)产物的方法，所述透明 质酸产物展示高度合意的性质。此方法提供最终交联步骤的良好控制，因为它仅在固体(沉 淀)相中发生。获得的产物独特在于，尽管具有低的HA的改性度，它是具有低的溶胀度的凝 胶。令人高度惊讶地，具有有限的溶胀度的凝胶产物完全可以用这样低的改性度来获得。在 许多应用中，此方法允许制造具有预先确定的形状的交联HA产物，该预先确定的形状是在 制造方法期间被保留的。该方法还允许制造生物相容的成型的交联的HA产物。
[0117]除非另外规定，术语"透明质酸"和"HA"被可交换地使用并且涵盖具有各种链长度 和电荷状态以及带有各种化学改性的透明质酸（hyaluronic acid)或透明质酸 (hyaluronan)的所有变体及变体组合。即，该术语还涵盖HA的各种透明质酸盐，例如透明质 酸钠(NaHA)。撤的各种改性还被该术语涵盖，例如氧化，比如CH 2OH基团氧化成C00H;邻位的 羟基基团的高碘酸氧化，任选地随后还原或亚胺形成等等;还原，例如COOH还原成CH2〇H;硫 化;脱酰胺，任选地随后脱氨基或与新的酸的酰胺形成;酯化;用各种化合物取代，例如使用 交联剂或碳化二亚胺;包括不同分子例如蛋白质、肽和活性药物组分与HA的偶合；以及脱乙 酰。对本领域技术人员熟知的是HA的各种形式具有在化学改性和分析期间不得不被考虑的 不同的化学性质。例如，如果合意的是获得具有某个PH的HA的溶液，那么将被溶解的材料的 酸度、溶解液体的酸度和任何缓冲容量都将影响获得的溶液的pH。
[0118] 优选的是HA底物是未经化学改性的HA或透明质酸盐，即HA底物在本发明制造方法 之前未经受交联或其他改性。
[0119] HA可以从动物源和非动物源的多种来源被获得。非动物源的来源包括酵母菌并且 优选地细菌。单个HA分子的分子量通常是在1.5-3MDa的范围内，但其他范围的分子量是可 允许的，例如〇.5-10MDa。
[0120] 通过该方法被制造的产物是交联的HA。该方法在HA链之间提供交联，这产生HA分 子的连续的成型的网络，所述HA分子通过共价交联、HA链的物理缠绕以及各种相互作用例 如氢键作用、范德华力和静电相互作用被保持在一起。根据本发明的交联的HA产物是凝胶 或水凝胶。即，它可以被认为是水不溶性的，但当经受液体通常含水液体时，它是大体上稀 释的HA分子的交联体系。
[0121] 获得的交联的HA产物优选地是生物相容的。这意味着在受治疗的个体中没有或仅 非常温和的免疫反应发生。
[0122] 因为交联的HA凝胶产物是高度复杂的化学结构，所以它们通常是用其化学结构和 其物理性质的组合来表征。在化学结构上与未改性的HA的偏离通常被记述为改性度 (degree of modification)、改性度(modification degree)、交联度、交联指数或化学改 性，这些都涉及共价结合至HA的交联剂的量。遍及本上下文，术语改性度将被使用。
[0123] 交联的HA凝胶产物的最相关的物理性质是凝胶可以吸收的液体的体积和凝胶的 流变性质。两个性质均描述凝胶的结构稳定性，常被称为凝胶强度或凝胶坚实度（gel firmness)，但尽管干凝胶的液体的吸收可以被确定，然而流变性质不得不在被溶胀至合意 浓度的凝胶上测量。液体吸收的传统表述是溶胀、溶胀能力、液体保持能力、溶胀度、溶胀的 程度、最大液体吸收和最大溶胀。遍及本上下文，术语溶胀度将被使用。关于交联的HA凝胶 产物的流变性质，可以注意到，旋转流变测定法仅仅对于确定液体的流变学有用，然而振荡 流变测定法对确定凝胶的流变学是必要的。测量产生就弹性模量和粘性模量而言凝胶对变 形的抵抗性。高的凝胶强度将给出溶胀至合意浓度的凝胶产物的对变形大的抵抗性。
[0124] 涉及植入物的某些已知的软组织填充治疗偶尔遭受植入物或其部分从合意的治 疗部位移开的缺点。为避免此问题，需要凝胶具有某种凝胶强度以便抵抗变形。此性质可以 使用振荡模式的流变测定法来测量。
[0125] 根据本发明的方法包括至少三个步骤，并且任选地由至少三个步骤组成：开始 (initial)或开始（initiating)交联步骤、交联剂除去步骤、以及最终（final)或完成 (finalizing)交联步骤。第一交联步骤可以采用许多不同的温度、时间和浓度来进行。在第 一交联步骤中，改性度被确定并且较小部分的交联发生。不论第一交联步骤如何被进行，有 效交联剂比在第二交联步骤期间被提高，通常被提高2-6倍或甚至更高。
[0126] 在第一方法步骤中，HA底物的交联被开始，或以另一种方式表述，HA底物的开始交 联被进行。HA底物存在于水溶液中并且被允许与一种或更多种多官能的交联剂反应。这导 致HA底物的大体交联，即两个分开的HA分子的共价耦合或同一HA分子的两个远离部分的共 价偶合在此步骤中已经被实现。如将由本公开内容的其他方法步骤明显的，交联剂仅在此 开始交联步骤之前或期间被添加。
[0127] 在优选的实施方案中，开始交联步骤提供凝胶形式的活化的HA。除了分开的HA分 子之间或同一 HA分子的远离部分之间的这些交联，这还导致大量交联剂在单一位置被共价 偶合至HA底物，并且从此步骤获得的HA被展示反应性交联功能的若干交联剂取代。获得的 活化的HA因此包含交联的HA分子和被展示反应性交联功能的交联剂取代的HA的混合物，交 联的HA分子中每个交联包括在(至少)两个分开的HA分子之间或在同一 HA分子的两个远离 部分之间的共价偶合，被展示反应性交联功能的交联剂取代的HA即通常包括仍然反应性的 交联剂与HA的单一共价偶合。
[0128] HA底物被溶解在水溶液中。通过术语"溶解(dissolved)"和"溶液"理解，HA底物存 在于具有液体的均匀混合物中，在该混合物中发生能量上有利的相互作用。将液体添加至 溶液降低了溶解的HA底物的浓度。溶液是含水的，即它包含水。水溶