联的HA纤 维、绳或线还可以被编织在一起以在完成的交联之后、干燥之前或之后形成网或膜。还可以 便利的是在其植入期间，在合意的位点使用部分地溶胀的、成型的凝胶产物以有助于施用 和最小化患者的不舒适并且通过使用剩余的溶胀能力增强提升能力。
[0157] 当成型的凝胶产物在液体过量下经受非沉淀条件时，还可允许地是确定其最大溶 胀度(SwD)，或相反地其最小HA浓度(Cmin)，即当凝胶产物完全被溶胀时的HA浓度。采用根据 本发明的制造方法，可允许地获得每克HA 4-500mL的溶胀度，并且优选地每克HA 15-300mL 的溶胀度。这意味着Cmin值在0.2-25% (w/w) 即2-250mg/g的范围内，例如0.3-7% (w/w) SP3-70mg/g的范围内。优选的是，Cmin值是0.3-5% (w/v)，即3-50mg/mL。高度有利的是，合意的溶 胀度(或Cmin值)可以用最小改性度来实现，但调节溶胀度的传统方式是通过改变改性度。本 发明制造方法因此提供调节成型的凝胶产物的溶胀能力的新概念，本方法令人惊讶地能够 产生具有与低的凝胶改性度有关的高C min值(低的溶胀度)的坚实的成型的凝胶。
[0158]改性效率(MoE)是凝胶的最小HA浓度(Cmin)或刚度/强度与其通过交联剂的化学改 性度(MoD)之间的比的度量。采用根据本发明的制造方法，可允许地是获得具有2或更高、优 选地在3-500的范围内、例如5-200或7-100的范围内的改性效率的交联的HA产物。不期望被 任何特定的理论限制，认为凝胶的有益性质是令人惊讶地高度有效交联的结果，即高度结 合的交联剂(有效交联剂比，通常35 %或更高，例如40%或更高，或者甚至50%或更高)事实 上在两个(或更多个)位点被结合到HA，与为合意的目的有效定位交联联合，并且可能地极 其高度的保留的缠绕。与技术人员将从获得的HA产物的低的改性度而期待的相反，根据本 发明的方法令人惊讶地提供了具有高的刚度/强度的凝胶。在任何情形下，根据本发明的方 法提供进一步调节与改性度有关的溶胀度的有用的方式。
[0159]任选地，制造方法还包括分离交联的HA产物的步骤。此步骤可以包括分离沉淀形 式的产物或非沉淀形式的产物，取决于产物是否被保持在沉淀条件下还是已经经受非沉淀 条件。然后，可以使分离的、沉淀的或非沉淀的产物经受灭菌，例如热压、辐射、加热等等以 便获得无菌交联的HA产物。
[0160]如果想要，可以在交联的HA产物已经被获得之后添加其他物质，比如局部麻醉药 (例如，利多卡因盐酸盐）、抗炎药物、抗生素和其他合适的支持性药物例如骨生长因子或细 胞。
[0161] 现在参照附图，一些优选的用于制造交联的HA产物的方法在图1-2中示意性地被 图示。在图1中示出的方法步骤的每个组合（1A-1F)提供交联的HA产物，但这些中的任何还 可以与如由虚线箭头图示的和如图2(2A-2D)中示例的另外的下游方法步骤的任何组合来 组合。
[0162] 最一般的方法在图IA中被图示，其中HA的交联通过使HA与多官能交联剂在水溶液 中反应以获得活化的HA来开始。任何未反应的交联剂从活化的HA中被除去。活化的HA的交 联通过使沉淀形式的活化的HA在不添加任何另外的交联剂下，在液体沉淀介质的悬浮液中 经受另外的交联条件来完成。这些步骤提供根据本发明的交联的HA产物，具有低的至中等 的改性度，而同时具有如通过低的至中等的液体保持能力（或溶胀度)示出的高的凝胶强 度。
[0163] 如在图1B-1C和1E-1F中所图示的，活化的HA的沉淀可以在溶液中的开始交联和完 成交联之间的任何时间发生。活化的HA的沉淀因此可以在未结合的交联剂的除去之前（图 1B、1E-1F)或在未结合的交联剂的除去之后（图1C)发生。
[0164] 根据本发明的方法还可以包括活化的HA的成型，如在图1D-1F中所图示的。成型可 以在溶液中的开始交联和完成交联之间的任何时间发生。成型因此可以在未结合的交联剂 的除去之前（图1D、1F)或在未结合的交联剂的除去之后（图1F)发生。成型还可以在活化的 HA的沉淀之前（图1E)或活化的HA的沉淀之后（图1F)发生。
[0165] 交联的HA产物还可以经受另外的下游方法步骤，例如在非沉淀条件下再溶胀和/ 或将产物分离和/或将产物灭菌。例如，交联的HA产物可以经受非沉淀条件并且从产生介质 中被分离，如在图2A中所陈述的。
[0166] 交联的HA产物还可以经受灭菌，例如热压处理，如在图2B-2D中所图示的。对于许 多应用，可优选的是即用装置，例如注射器，用交联的HA产物来加载，如在图2C-2D中所图示 的。HA产物可以在被加载进入装置之前（图2D)或在被加载进入装置之后（图2C)被灭菌，例 如热压处理。
[0167] 根据一个方面，本发明提供交联的HA产物。根据一种实施方案，产物通过本发明的 制造方法被制造或可以被制造。根据本发明的交联的HA产物是凝胶或水凝胶。即，它可以被 认为是水不溶性的，但当经受液体通常含水液体时，它是大体上稀释的HA分子的交联体系。 凝胶按重量计大部分是液体并且可以例如包含90-99.9 %的水，但由于在液体中三维交联 的HA网络，它行为像固体。由于其明显的液体含量，成型的凝胶在结构上是弹性的并且与天 然组织相似，这使得它在组织工程中用作支架和用于组织填充是非常有用的。与HA链的天 然缠绕一起，交联和它们在HA分子的附接位置赋予凝胶其结构和性质，这与其溶胀度密切 相关。
[0168] 附接的交联剂的量可以通过改性度(MoD)来定量且被记述为改性度，改性度即相 对于重复的HA二糖单元的总数目而言结合的交联剂的摩尔量。优选的是，根据本发明的交 联的透明质酸产物具有每1000个二糖单元1-90个交联剂单元的改性度(0.1-9% )，优选地 每1000个二糖单元1-40个交联剂单元的改性度(Ο . 1-4% )。交联反应的有效性通过在（至 少)两端被连接至一个(或更多个)HA链的附接的交联剂的量来示出，并且被记述为有效交 联剂比（CrR)。现在令人惊讶地认识到且在实验上示出，通过将交联反应分成两个分开的步 骤，和特别地通过包括在最终交联步骤之前的HA沉淀步骤，CrR可以有利地多方面被提高。 具体地，CrR通过最终交联步骤被提高至少1.5倍，并且优选地2-10倍，例如2-6倍。可优选的 是，根据本发明的产物具有35%或更高、更优选地40%或更高，例如在40-80%的范围内、或 甚至在50-80 %的范围内的有效交联剂比。这些产物因此具有低数目的在产物中未提供有 效交联的交联剂。高的有效交联剂比允许与凝胶强度有关的令人惊讶地低的总改性度，这 依次有利地确保高的生物相容性。
[0169] 凝胶的另一个特性是其吸收水直到它完全被溶胀的能力。另外添加液体将不进一 步稀释凝胶，即凝胶不能像自由分子的溶液那样无限地被稀释。当凝胶经受非沉淀条件时， 这还可允许地确定其溶胀度，或相反地其最小HA浓度(C_)，即当凝胶产物完全被溶胀时的 HA浓度。较硬的（低溶胀)凝胶通常是与较软的（高溶胀)凝胶相比较少粘性、更有弹性并且 预计具有更长的体内半衰期。然而，如果较硬的凝胶是高度化学改性的，那么它们可能被身 体认为是外来材料。优选的是，根据本发明的产物具有每克HA 4-500mL的溶胀度，并且优选 地每克HA 15-300mL的溶胀度。这意味着Cmin值在0.2-25% (w/w)的范围内，即2-250mg/g，例 如在0· 3-7% (w/w)的范围内，即3_70mg/g。优选的是，Cmin值是0· 3-5% (w/v)，即3_50mg/mL。
[0170] 根据本发明的交联的HA产物用是多官能的一种或更多种交联剂来交联，即它具有 用于与正被交联的HA分子形成共价键的两个或更多个反应位点。优选的是，交联剂是双官 能的，即它具有用于与正被交联的HA分子形成共价键的两个反应位点。不受限于那些，有用 的多官能交联剂包括二乙烯砜、多环氧化合物和双环氧化合物，例如1，4_ 丁二醇二缩水甘 油醚(BDDE)、1，2_乙二醇二缩水甘油醚(EDDE)和二环氧辛烷，优选地BDDE。合意的是，HA凝 胶产物用醚交联来交联，这提供合适的稳定性。
[0171] 成型的HA凝胶产物可以是多重交联的，即包含至少两种不同类型的键，优选地包 括醚键。优选的是，HA产物是单交联的，即实质上包含单一类型的交联，优选地醚交联。单交 联的产物具有化学上很好被定义的优点。有利的是，具有单一交联类型的产物展示这样的 合意的性质。在特定的实施方案中，HA产物用醚交联来交联，这提供稳定的和可加热加压的 产物。
[0172] 尽管调节溶胀度的传统方式是通过改变改性度，然而高度有利的是产物的合意的 溶胀度(或(^"值)用最小改性度来获得。最小化改性度的主要原因是确保凝胶的生物相容 性是高的，但技术人员很好地认识到其他优势。成型的产物用与凝胶的改性度有关的高的 Cmin值(低的溶胀度)来表征。改性效率(MoE)是最小HA浓度(Cmin)(反映凝胶的刚度和强度） 与用交联剂的凝胶的化学改性度之间的比的度量。根据本发明的交联的HA产物具有2或更 高的改性效率，优选地在3-500的范围内例如在5-200或7-100的范围内的改性效率。具有10 或更高例如在20-190的范围内的改性效率的产物第一次兼备低的至中等的改性度并且同 时低的至中等的溶胀度或液体保持能力。从而，可允许地提供是生物相容的且对变形具有 高的抵抗性的、坚实的、交联的HA产物。
[0173] 此外，可优选的是，根据本发明的交联的HA凝胶产物是粘弹性的。这意味着凝胶产 物展示粘性性质和弹性性质的组合。如技术人员熟知的，粘弹性可以用流变仪来确定。在振 荡模式中，弹性模量(G'）和粘性模量(G")可以在O. IHz或IHz的频率来确定。对于根据本发 明的某些粘弹性凝胶产物，优选的是满足以下关系：
[0175] 根据本发明的产物可以以预先确定的外形或结构例如颗粒、纤维、绳、线、网、膜、 圆盘或珠被制造。优选的是，当HA底物是以溶胀形式在生理盐水中时，形状具有小于5mm、优 选地小于1_，并且大于0.5mm或甚至大于0.8mm的延伸。优选的形状是具有当完全被溶胀于 生理盐水中时0.1-5. Omm例如0.5-1_的大小的颗粒或珠。
[0176] 根据本发明的一种实施方案，交联的HA凝胶产物可以被用作药物递送装置和在药 物递送的方法中被使用。
[0177] 根据本发明的交联的HA产物用于使皮肤保湿和/或使皮肤有生机。为此目的，产物 可以例如被注射进入皮肤或被包含在应用于皮肤的乳膏中。
[0178] 根据本发明的交联的HA产物被用于整容或医学手术。整容手术的非限制性实例是 皮肤填充、体形塑造和面部塑造，特别地面部塑造。医学手术的非限制性实例是皮肤填充、 体形塑造、组织粘连的预防、矫形外科应用、失禁治疗、膀胱输尿管反流(VUR)的治疗、以及 用于排泄目的例如眼科学中和用于保持组织分开的通道的形成。
[0179]根据一方面，本发明提供经历整容或医学手术的受试者的治疗的方法，包括将根 据本发明的交联的HA产物施用于需要其的受试者。医学手术的非限制性实例是皮肤填充、 体形塑造、组织粘连的预防、矫形外科应用例如臀部和关节治疗、以及用于排泄目的例如眼 科学中和用于保持组织分开的通道的形成。
[0180] 合意的形状和大小在产物的制造期间被排列，即通过在完成交联之前将底物排列 成合意的形状。获得合意的结构大小的另一种合适的方式包括，在合意的浓度制造交联的 HA凝胶产物并且使该凝胶经受机械破坏，例如将溶胀的或部分溶胀的凝胶或者沉淀的交联 的产物切碎、捣碎或通过具有合适的孔大小的过滤器或筛。将获得的凝胶颗粒或块分散在 生理盐溶液中，导致具有合意的大小和形状的颗粒的凝胶分散液或浆料。取决于形状，凝胶 结构的大小可以以任何方式例如通过激光衍射、显微镜、过滤等等来确定，并且由颗粒的两 端之间的最长的距离来决定。对于球体结构，直径等于此目的的大小。
[0181] 有用的凝胶结构大小范围和形状取决于所意图的应用。对于软组织填充，优选地 皮下施用、肌肉下施用或骨膜上（supraperiostal)施用，具有当经受生理盐溶液时大于 0.1mm的大小的凝胶颗粒、块或纤维是有用的。如本文所使用的，术语"软组织填充（soft tissue augmentation)"指的是任何类型的软组织的体积填充，包括但不限于，面部塑造 (例如，更明显的面颊或下巴）、凹畸形的矫正(例如，受伤后的、HIV相关的脂肪萎缩)和深的 年龄有关的面部褶皱的矫正。因此，软组织填充可以单独地被用于整容目的或用于医学目 的，例如创伤后或退行性疾病。这两个目的容易地被技术人员区分。如本文所使用的，术语 "软组织"指的是连接、支撑或围绕身体的其他结构和器官的组织。软组织包括肌肉、纤维组 织和脂肪。软组织填充可以在任何哺乳动物包括人类中进行。优选的是，该方法在人类受试 者中进行。
[0182] 如本文所使用的，术语"表皮下施用（subepidermal administration)"或"表皮下 施用（subcuticular administration)"指的是在皮肤的表皮下施用，包括施用进入真皮、 皮下组织或更深，例如