肌肉下地或进入其中可应用的骨膜中（在骨组织附近）。
[0183] 凝胶结构的施用可以以任何合适的方式进行，例如通过来自合适大小的标准插管 和针的注射或者手术插入，例如在施用膜的情况下。在软组织填充是合意处进行施用，例如 下巴、面颊或者面部或身体上的其他地方。优选的是，在面部塑造中使用凝胶和凝胶结构。
[0184] 根据本发明的植入物可以是含水组合物，所述含水组合物包含根据本发明的交联 的HA产物，以及任选地缓冲剂和/或张度剂，所述交联的HA产物例如以2 0 . Imm的大的HA凝 胶结构的形状，例如颗粒、珠、纤维或切断的条纹物。组合物可以通常包含生理盐缓冲剂。组 合物还可以包含其他合适的活性物质和医学化合物，例如局部麻醉药(例如，利多卡因盐酸 盐）、抗炎药物、抗生物和其他合适的支持性药物例如骨生长因子或细胞。根据本发明的交 联的HA产物或其含水组合物，可以以预填充的注射器来提供，即用灭菌的、交联的HA产物或 包含成型产物的灭菌的含水组合物来预填充的注射器。任选地，交联的HA产物可以在注射 器、袋或其他合适的容器中以沉淀的形式被保持并且在注射之前或在其注射后的体内被带 至其非沉淀形式。
[0185] 优选的是，溶胀的或部分溶胀的、交联的HA产物是可加热加压的，因为这是将最终 产物灭菌的最便利的方式。这允许制备无菌的、交联的HA产物。
[0186] 不言而喻，根据本发明的凝胶结构（例如纤维）的大小取决于，凝胶已经被允许溶 胀多少，以及被包含在凝胶结构中和/或围绕凝胶结构的缓冲剂、溶液或载体的离子强度。 遍及本说明书，给出的结构大小承担生理条件，特别地等渗条件。应注意，尽管优选的是凝 胶结构包含生理盐溶液并且被分散在生理盐溶液中，然而认为通过使凝胶结构经受另一种 张度的溶液、不同的PH或者如果凝胶结构尚未被允许溶胀至其最大大小，根据本发明的凝 胶结构可以暂时地被带至不同大小。
[0187] 如本文所使用的，生理的或等渗的溶液是具有在200m0Sm/l-400m0sm/l范围内、优 选地250m0sm/l-350m0sm/l、更优选地大约300m0sm/l的渗透性(osmo Iar i ty)的溶液。
[0188] 根据本发明的交联的HA产物在生理条件下是稳定的，但不是永久的。根据本发明 的实施方案，至少70%、优选地至少90%的交联的HA凝胶产物保留在体内持续至少两周，更 优选地在两周和两年之间。术语"降解的"意味着小于20%、优选地小于10%的介质保留在 体内。
[0189] 根据本发明的交联的HA凝胶产物不仅比天然的HA而且比商购的交联的HA凝胶产 物，对体内生物降解更有抵抗性，参看实施例8和实施例9。稳定的凝胶产物的延长的存在对 患者是有利的，因为治疗之间的时间被增长了。还重要的是，该产物与天然的HA高度相似， 以便保持天然的HA的高的生物相容性。
[0190]
[0191 ]遍及本公开内容，以下术语被定义如下。
[0192] 术谱: 性质 .含义 HA HA指的是透明质酸钠 凝胶形式 凝胶形式HA是不能通过用（例如盐水）冲洗来从凝 HA 胶中提取的交联的HA，与可提取的HA相对。 可提取的 可提取的HA是能够通过用（例如盐水）冲洗来提取 HA 的交联的或不交联的HA Cha HA浓度
以 mg/g、mg/mL. % (vv/w)、％ (w,''v)表示 SwD. 溶胀度 SwD优选地以g/g、mL/g、或作为无量纲的数来表示。 SwD是在0,9%盐水中完全被溶胀的凝胶中凝股形式 HA的倒数的浓度（inverted concentration ),即每无千 的交联的HA能够形成的完全溶胀的凝胶的体积或质 量。SwD描述产物的最大液体吸收（0,9%益水）能力。 Gmi8 最小HA浪度 在0.9%盐水中完全溶胀的凝股中凝胶形式HA的浓 度.，.常以nig/g或mg/mL.表示。
GelC 凝胶含量
表示为g/g、无量纲的数、或％。凝胶含量是产物中从 总HA含量之中被结合的凝肢形式HA的比例。
[0193] 术语 性质 含义 MoD 改性度
表示为摩尔/摩尔，无量纲的数、或摩尔％" MoD描 述了被结合到HA的交联剂的量，即相对于重复??Α. 二糖单元的总摩尔量而言结合的交联剂的摩尔'量 MoD反映了 HA已经被交联剂化学改性的程度。 CiR 有效交联剂比
其中X是交联剂。CrR还可以表示为：
以摩尔/摩尔、：无量纲的数、或摩尔％表示。有效交联 剂比描述已经结合两个（或更多个）二糖（仅 HA-X-1-1A )的总结合的交联剂（HA-X-HA和HA-X ) 的比例。 MoE 改性效率
MoE是作为以mg/g表示的C画和以％表示的MoD之 间的比而获得的无量纲的数。MoE描述了既有通过化 学改性又有由分子缠绕引起的相互连接的量，其是以 通过交联剂的某种程度的化学改性为代价来实现的。 实例：对于具有Cmin=SS mg/mL和MoD=l<15S4的产' 物，：M.oB太.约是30U并且计算如下：
G' 弹性模量 烊性模量描述凝胶对弹性变形的抵抗性，并.Jl以Pa. (帕斯卡）来表示。与弱的凝胶相比，强的凝胶将给 出较大的数·<
[0194] 术语 性质 含义 Om 粘性模量 粘性模量描述凝胶对粘性变形的抵抗性，并且以Pa (帕斯卡）来表示。与G'一起，它描述对变形的总抵 抗性。
[0195] 不期望被那些限制，本发明将在下文通过实施例的方式来说明。 实施例
[0196] 分析方法
[0197] HA浓度的确定
[0198] 确定HA含量的方法采用来自Ph. Eur. 1472中描述的透明质酸钠的测定试验。该方 法的原理是在硫酸中通过加热形成的糠醛衍生物与咔唑试剂发生缩合反应，形成紫色的产 物。该反应特异的针对HA的D-葡萄糖醛酸部分。在530nm处测量到吸光度，并且葡萄糖醛酸 被用于标定。
[0199] 在样品中由D-葡萄糖醛酸(GlcA)的含量形成的产物通过与咔唑反应来确定。为得 到均匀的样品溶液，HA的稳定了的凝胶用硫酸在70°C来降解并且用0.9%NaCl溶液来稀释。 将溶液与硫酸在95°C混合并且其后与咔唑试剂混合。反应导致粉色的溶液。颜色的强度用 色度计在530nm处测量，并且每个样品的吸光度与GlcA含量成正比。HA含量计算自每个样品 中的G IcA含量。
[0200] 凝胶含量(GelC)的确定
[0201] GelCW%描述被结合的凝胶形式的总HA的比例。凝胶含量被定义为在样品中不通 过0.22μηι过滤器的HA的量。Ge IC计算自在滤液中收集的HA的量，这里表示可提取的HA。凝胶 含量和可提取的HA含量以凝胶样品中的HA的总量的百分数来给出。简言之，凝胶含量通过 在试管中用〇.9%NaCl混合某种量的凝胶样品来确定。凝胶被允许溶胀，随后通过过滤通过 0.22μπι过滤器来将NaCl相从凝胶相中分离。HA在滤液中的浓度根据用于确定HA浓度的程序 来确定。
[0202] 溶胀度(SwD)的确定
[0203] SwD描述HA水凝胶产物的液体吸收能力，即其吸收0 · 9%NaCl的能力，并且被记述 为每克HA的获得的完全溶胀的凝胶的重量(按克计）。产物通常是部分溶胀的、交联的HA凝 胶，但还可以以干的状态存在。SwD可以由溶胀因子(SwF)来确定。SwF作为一旦将某种重量 (w)的部分溶胀的产物在量筒中以盐水溶胀时形成的完全溶胀的凝胶的体积(V)来测量，并 且计算为：
[0205]然后，SwD被计算为：
[0207] 其中[HA]是部分溶胀的凝胶的HA浓度（按g/mL凝胶计），并且GelC是凝胶含量 (按％计）C3GelC被包含在式中以校正可提取的HA含量，可提取的HA含量将不助于凝胶的溶 胀。假定完全溶胀的凝胶的密度是I .〇g/mL。
[0208] 值得注意地，较强的凝胶将具有较低的SwD，同时较弱的凝胶将具有较高的SwD。
[0209] 最小浓度(Cmin)的确定
[0210] Cmin(或Cmin)描述在0.9%NaCl中完全被溶胀的交联的HA凝胶产物在除去所有可提 取的HA之后，其中的凝胶形式HA的浓度。因为产物不能吸收更多的液体，此浓度对于此具体 凝胶产物是可以获得的最小HA浓度。值得注意地，较强的凝胶将具有较高的Cmin，同时较弱 的凝胶将具有较低的C min。
[0211 ]类似于如以上所陈述的SwD的确定，采用如下关系式来确定Cmin (按mg/mL或mg/g 计）
[0213] 改性度(MoD)的确定
[0214] MoD描述相对于重复的HA二糖单元的总数，结合的交联剂的摩尔量(Kenne等人， Carbohydrate Polymers 91(2013)410-418)。此度量不在单连的和实际上交联的交联剂之 间区分，即通过至少一个共价键被结合到HA的所有交联剂都被包括。例如，对于用BDDE交联 的HA凝胶，1 %的MoD意指在HA凝胶中每100个二糖单元有1个结合的（单连的或交联的)BDDE 分子。
[0215] 在酶催化降解的凝胶产物上采用NMR波谱学来确定MoD。可溶的HA、剩余的（非结合 的）交联剂和其衍生物在凝胶的降解之前通过在〇.22μπι过滤器上过滤被洗去。在37°C通过 采用软骨素酶的酶处理来降解凝胶产物。通过在装配有标准5mm探针的500MHz波谱仪上记 录一维 1H NMR波谱，使降解的凝胶产物经受NMR波谱。
[0216] NMR波谱通过在δΗ1.6ppm处的信号（其源自连接的BDDE分子中的四个质子)和在δ Η2. Oppm处的信号(其来自HA二糖的N-乙酰基葡糖胺残基上的CH3基团中的三个质子)的积分 来评价。在对负责每种信号的质子的数目校正之后，这两种信号的积分之间的比与结合的 BDDE和二糖的摩尔量之间的比成比例，因此给出MoD。
[0218] 改性效率(MoE)的确定
[0219] MoE是凝胶的最小HA浓度和改性度之间的比，即：
[0221] Cmin(mg/g或mg/mL)和M〇D( % )如在前所描述地来确定。因为Cmin与凝胶的强度紧密 相关，所以MoE是交联程序在产生合意强度的凝胶中是多有效的度量。具有高MoE的方法将 产生具有高(：_和低MoD的凝胶，即，尽管有限的HA的化学改性，然而产生了强的凝胶。
[0222] 有效交联剂比(CrR)的确定
[0223] CrR描述已经结合两个(或更多个）二糖（仅HA-X-HA)的总结合的交联剂(HA-X-HA 和HA-X)的比例：
[0225] 其中X是交联剂。
[0226] 该方法基于在使用来自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)的软骨素酶AC或 来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的软骨素酶ABC将HA凝胶降解成由主要二糖（Δ di-HA)组成的片段和包含1-8个二糖的具有结合的交联剂(HA-X)的片段之后，使用LC-MS确定 HA-X片段。片段可以采用尺寸排阻色谱法(SEC)被分离，以及采用质谱法(MS)被检测。求和 每组片段的峰面积，并且CrR被计算为：
[0228]假定所有类型的HA-X片段在MS检测器中具有相同的响应，即某个峰面积对应于所 有类型的HA-X片段的给定的摩尔量(Kenne等人，Carbohydrate Polymers 91(2013)410-418)〇
[0229]当确定CrR时，应该小心地仅包括通过醚键合来结合的BDDE。取决于交联期间的条 件，BDDE既可以通过醚键合又可以通过酯键合结合到HA。因为酯键合容易被水解，所以仅醚 结合的BDDE将有助于在长期的凝胶强度和持续时间。具有酯结合的BDDE的片段具有与醚结 合的BDDE相同的质量，但是由于它们具有稍微不同的色谱保留时间，所以它们可以被检测。 为确定不具有任何酯结合的BDDE的CrR，样品应该在分析之前被水解。样品的水解可以，例 如在酶催化降解之前或之后，通过添加碱和/或加热来做出。
[0230]尽管用于确定CrR的方法现在已经使用BDDE交联的HA作为示例性实施例来描述 了，然而它绝不局限于此特定的组合的交联剂和多糖。采用在(Kenne等人,Carbohydrate Po I ymer s 91 (2013) 410-418)中概述的原则并且在LC-MS取得方法中针对所使用的特定的 交联剂校正/修正HA-X片段和HA-X-HA片段的质量，该方法可以容易地适于任何其他多官能 的交联剂。
[0231] 流变测定法
[0232] 振荡模式的流变测定法被用于确定溶胀的凝胶产物的粘弹性质。弹性模量(G'）描 述凝胶对弹性变形的物理抵抗性方面的凝胶强度。粘性模量(G"）描述凝胶对粘性变形的物 理抵抗性方面的凝胶强度。使用振荡流变仪进行测量。
[0233] 进行流变测定法测量如下。具有在样品加载和测量之间至少15分钟的静止时间以 及0.1 %的应变（γ )来进行频率扫描。具有25mm的直径的平行板探针以Imm或2mm的间隙被 使用。弹性模量(G'）和粘性模量